空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗的免疫原性研究

目的初步探讨自制的空肠弯曲菌(campylobacterjejuni,CJ)亚单位(Mr28000～31000外膜蛋白)脂质体佐剂疫苗的免疫原性,为该疫苗的临床前研究打下基础。方法用双向免疫琼脂扩散试验、试管凝集试验、ELISA(间接法)分别检测经CJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体效价。结果CJ阴离子组与CJ阳离子组比较,血清IgGA值显著增高(P<0.01),与CJ弗氏组无统计学差别(P>0.1);CJ阴、阳离子组脂质体疫苗接种剂量在0.50mgkg时,血清IgGA值最大;CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgGA值无统计学差别(P>0.1);特异性IgG抗体经6个月动态观察,5个月后抗体效价下降。结论实验组全程免疫后均有特异性抗体产生;同一剂量的阴离子脂质体疫苗比阳离子脂质体疫苗血清抗体水平显著增高;脂质体疫苗最佳接种剂量为0.50mgkg,肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异;特异性抗体高水平维持5、6个月后应加强免疫。

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。

不同培养基上空肠弯曲菌生长特性及外膜蛋白表达差异的初步研究

目的探讨不同培养基对空肠弯曲菌(CJ)的生物学特性和外膜蛋白表达的影响。方法采用改良布氏、改良布氏血、改良卵黄等3种培养基培养CJ,48h后进行菌落观察、菌体观察、动力学试验、生物化学检验、间接荧光检测等初步确定生物学特性,比较3种培养基上CJ生长特性的差别。采用0.2mol/L、pH2.2甘氨酸-HCl缓冲液抽提CJ外膜蛋白,SDS-PAGE电泳后,灰度扫描观察比较不同培养基上CJ的28000～31000外膜蛋白表达差异。结果改良卵黄培养基上CJ的生长特性典型,并且其菌体形态较另外两种培养基粗壮,繁殖速度更为快速,改良卵黄培养基来源的CJ的28000～31000外膜蛋白的表达较改良布氏血培养基丰富。结论改良卵黄培养基培养CJ是一种生长特性典型、28000-31000外膜蛋白表达丰富的培养基,该培养基的选择和使用将为该类蛋白的CJ亚单位疫苗大规模制备、CJ的流行病学检验、食品安全卫生检验检疫奠定重要基础。

空肠弯曲菌67KD 外膜蛋白的提取及其对淋巴细胞的多克隆激活作用

本室曾建立空肠弯曲菌诱导自身免疫综合征小鼠模型.本文用盐析法及离子交换层析法从空肠弯曲菌(CJ-S131)中提取了67KD 的外膜蛋白.免疫印迹法证实该蛋白为空肠弯曲菌的主要抗原成份之一,具有较强的免疫原性;体外对小鼠脾淋巴细胞具有明显的多克隆激活作用.本实验为从分子水平研究感染与自身免疫的关系提供了重要的物质基础和新的实验依据.

空肠弯曲菌28-31 ku外膜蛋白的免疫原性

目的:探讨空肠弯曲菌28-31 ku外膜蛋白的免疫原性. 方法:将BALB/c小鼠分为正常对照组和不同剂量抗原的免疫组,正常对照组不予抗原免疫,而免疫组采用28- 31 ku蛋白(纯)或甘氨酸提取的外膜蛋白(粗),分别加用或不加用完全弗氏佐剂(F),采用sc,在0,1,2,3, 4 wk免疫,于末次免疫后10 d,用双向免疫琼脂扩散试验测定各免疫组抗血清效价,待效价达到1:4至1:16 时.分别采集各免疫组及对照组小鼠的血清、空肠及回肠内的肠液,用间接ELISA法检测各组标本的特异性抗体IgA,IgG. 结果:不同剂量的抗原sc免疫BALB/c小鼠后,免疫组血清及肠液中特异性IgA,IgG抗体水平较正常对照组及实验对照组显著升高(P<0.05). 结论:空肠弯曲菌的28-31 ku外膜蛋白是一种良好的免疫原,能够诱导BALB/c小鼠产生特异性抗体,可能成为空肠弯曲菌亚单位疫苗候选的重要组分.

空肠弯曲菌28KD^31KD外膜蛋白的初步提取及鉴定

目的:探讨空肠弯曲菌28KD^31KD外膜蛋白的提取方法及其鉴定。方法:采用改良布氏肉汤培养基培养空ν淝?Campylobacterjejuni,CJ),用0 2mol/L、pH2 2甘氨酸-HCl缓冲液提取CJ外膜蛋白,SephadexG-75分子筛层析法纯化28KD^31KD分子,SDS-PAGE分子量鉴定,Westernblotting印迹法鉴定CJ甘氨酸提取物中外膜蛋白及纯化的28KD^31KD分子抗原性。结果:以甘氨酸提取CJ的外膜蛋白,SephadexG-75层析纯化能够提取出CJ28KD^31KD外膜蛋白,该蛋白分子能够与CJ兔抗血清发生特异性反应。结论:采用甘氨酸提取、SephadexG-75纯化CJ28KD^31KD外膜蛋白系一种稳定可靠的分离层析方法,提取的CJ28KD^31KD外膜蛋白具有良好的抗原性,为特异性的CJ28KD^31KD外膜蛋白的多克隆抗体制备、CJ感染的血清学特异性诊断、CJ亚单位疫苗的研制打下基础。

空肠弯曲菌外膜蛋白福氏佐剂疫苗免疫小鼠后的抗体应答

目的探讨空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白福氏佐剂疫苗免疫小鼠后的抗体应答效果。方法将30只BALB/c小鼠随机分为5组,每组6只,采用空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白以不同剂量疫苗组,分别在第0、7、14、21、28天,通过背部及腹部皮下多点注射免疫小鼠;空白组、对照组分别采用0.4 mL生理盐水(NS)、0.4 mL福氏完全佐剂。在末次免疫10 d(即第38天),分别应用双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价,ELISA检测血清和肠液中的特异性IgG、IgA、。结果末次免疫10 d后,各疫苗组中,双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价分别达到1∶4～1∶16和1∶320～1∶1 280,ELISA法检测血清、肠液中IgG、IgA、的水平与空白组、对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);空白组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31 kd外膜蛋白佐剂疫苗能够诱导BALB/c小鼠较好的体液免疫应答和高水平的肠液抗体,将为空肠弯曲菌亚单位疫苗的深入研究奠定重要的实验依据。

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫原性研究

目的探索用脂质体包裹空肠弯曲菌（Camffylobaeter jejuni，CJ）Mr28000～31000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的cJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径。方法采用薄膜一超声一冻融法制备阴离子脂质体（AL）、阳离子脂质体（CL）GJ疫苗后对其进行质量鉴定；用ELISA（间接法）检测经GJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体水平。结果①疫苗无菌试验及热原质试验均合格，均无明显不良反应；②阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32．1％、22．5％，冻融后分别是38．3％、28．4％；③CJ阴离子组比GJ阳离子组血清IgG的OD值显著增高（P〈0.01），与GJ弗氏组无统计学差别（P〉0.1）；CJ阴、阳离子组0．50mg／kg的免疫剂量血清IgG的0D值最大；CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgG的0D值无统计学差别（P〉0．1）；特异性IgG抗体经6个月动态观察，5个月后抗体效价下降。结论①采用薄膜-超声-冻融法制备GJ亚单位佐剂疫苗安全、稳定，冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率；②同一剂量的阴离子脂质体疫苗血清抗体水平明显高于阳离子脂质体疫苗；③脂质体疫苗最佳接种剂量为0．50mg／kg，肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异；④较高水平的特异性抗体维持5个月，6个月后应加强免疫。

空肠弯曲菌双分子荧光互补系统构建及其在蛋白质互作研究中的应用

为研究空肠弯曲菌中蛋白质的相互作用,建立适合于该菌稳定高效表达的双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)系统,通过构建基于基因启动子、荧光蛋白以及基因回补方式等不同条件的重组载体,分别导入空肠弯曲菌进行荧光数值比较分析,确定荧光表达最优的参数,建立以porA启动子和Venus荧光蛋白的质粒回补的BiFC体系。用该体系探究空肠弯曲菌鞭毛表达蛋白的互作。结果表明:已知flhF与flhG互作的BiFC-flhF-flhG载体在菌体内表达的荧光值显著高于阴性对照载体,而BiFC-flhF-fliM和BiFC-flhF-fliG与阴性对照无差异,说明BiFC体系建立成功,且flhF与fliG、fliM不存在互作关系。综上,本研究建立了适用于空肠弯曲菌的BiFC体系,可为该菌蛋白质互作研究提供高效便捷的方法。

空肠弯曲菌67KD 外膜蛋白诱导抗核抗体生成

在分离提取空肠弯曲菌 S—131主要膜抗原成份67KD 鞭毛蛋白的基础上,用此蛋白成份经腹腔免疫8周龄雌性 KM 小鼠,每周一次,共12周,ELISA 方法动态测定小鼠血清中自身抗核抗体(包括抗 ds-DNA,ss-DNA 和组蛋白抗体)的水平。发现输注剂量为120—200μg/次/小鼠时能成功诱导上述各类自身抗体的产生,其中抗组蛋白抗体的阳性反应性最大,出现时间较早.本研究为从分子水平研究慢性感染诱致自身免疫的机理提供了新的实验依据,为抗组蛋白抗体作临床早期诊断的潜在作用提供了佐证.

不同培养基条件来源空肠弯曲菌外膜蛋白纯化及其表达差异

目的探讨不同培养基培养条件下空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)Mr28000～31000外膜蛋白的纯化方案及表达差异。方法分别采用改良布氏血琼脂培养基(以下简称Bull’s)、改良卵黄培养基(以下简称Yolk)培养CJ,比较两者的生长特征。制备CJ全菌抗血清。0.2mol/L、pH2.2甘氨酸-HCl缓冲液抽取CJ外膜蛋白,Sephadex G-75层析法纯化其中的Mr28000～31000蛋白。SDS-PAGE技术检测Mr28000～31000外膜蛋白表达情况和含量差异,Western-blotting检测该类蛋白的抗原性。结果卵黄培养基培养的细菌生长更典型,SephadexG-75层析能够稳定可靠地纯化CJ细菌Mr28000～31000外膜蛋白,卵黄培养基培养来源的CJ的Mr28000～31000表达量占酸提取物的70%,大于改良布氏血琼脂培养基培养来源的表达量48%,两种培养基来源的CJ的Mr28000～31000蛋白成分均与CJ全菌兔抗血清发生免疫反应。结论不同培养基来源CJ的Mr28000～31000外膜蛋白均能被SphadexG-75分子筛纯化,该类蛋白能够在改良卵黄培养基上更高效表达,不同培养基来源的该类蛋白均具有良好的抗原性,该培养基的使用和该类蛋白有效提取为CJ感染的血清学特异性诊断及疫苗的研制奠定基础。

空肠弯曲菌在两种培养基上外膜蛋白中的表达及其体液免疫应答比较

目的探讨不同培养基来源的空肠弯曲菌28～31kD外膜蛋白免疫小鼠后的体液免疫应答效果。方法将66只BALB/c小鼠分别随机分为11组,每组6只,采用布氏血培养基、改良卵黄培养基培养来源的空肠弯曲菌甘氨酸提取28～31kD外膜蛋白以不同剂量疫苗组(50、100、200μg/只,加入0.2mL福氏完全佐剂),分别在0、7、14、21和28d,通过背部皮下+腹部皮下多点注射免疫小鼠;空白组、对照组分别采用0.4mLNS、0.4mL福氏完全佐剂。在末次免疫后10d(即第38天),分别应用双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价,采用ELISA技术分别检测小鼠血清和肠液中的特异性抗体IgG、IgA、分泌型IgA(sIgA)的水平。结果末次免疫后10d后,两种培养基来源的各免疫组中,双向免疫琼脂扩散试验法、试管凝集法检测血清特异性抗体效价分别达到1∶4～1∶16和1∶320～1∶1280,间接ELISA法检测两种培养基来源血清、肠液中IgG、IgA、sIgA的水平与空白组、对照组差异均有显著性(P<0.05);两种培养基来源的同剂量组的疫苗之间IgG、IgA、sIgA的水平差异没有显著性(P>0.05);空白组与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论改良卵黄培养基来源的空肠弯曲菌甘氨酸提取物28～31kD外膜蛋白能够诱导BALB/c小鼠较好的体液免疫应答和高水平的肠液sIgA抗体,与改良布氏血培养基相同,该培养基的选择和使用将为CJ亚单位疫苗、CJ检验、CJ食品卫生检疫的深入研究奠定重要的实验依据。

空肠弯曲菌外膜蛋白对巨噬细胞的活化作用

用甘氨酸一盐酸法提取空肠弯曲菌主要外膜蛋白，观察经免疫小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、碳素廓清率及抗原介导粘附抑制率。结果说明，经免疫后的巨噬细胞吞噬功能和碳素廓清率均明显高于对照组，但抗原介导巨噬细胞粘附抑制率则无显著差异。

空肠弯曲菌外膜蛋白抗血清的制备及其对肠道病原菌鉴别的初步应用

目的：探讨空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，CJ）28KD-31KD外膜蛋白兔抗血清的制备及其对常见肠道病原菌的检测的菌属特异性。方法：采用CJ活菌静脉注射、CJ28KD-31KD蛋白多次、多点皮下注射分别免疫新西兰种大白兔制备抗血清，Western—blotting法鉴定抗血清的抗原性。纯培养的痢疾志贺氏茸、甲型副伤寒沙门氏菌、肖氏沙门菌，希氏沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、变形杆菌、空肠弯曲茸（CF-1）（茼浓度1X109CFU／m1）等常见的肠道病原菌，分别与不同稀释倍数的CJ活菌抗血清和CJ28KD-31KD外膜蛋白抗血清进行常规的直接凝集反应（试管法），观察抗血清对各种已知肠遣病原菌的属的特异性。结果：制备了cJ28KD-31KD外膜蛋白的兔抗血清，CJ活菌抗血清能够与全部CJ甘氨酸提取物发生免疫反应，CJ28KD--31KD外膜蛋白抗血清仅与28KD-31KD外膜蛋白发生反应。CJ活菌抗血清能够与常见肠道病原体发生凝集反应，而CJ28KD-31KD蛋白抗血清仅与空肠弯曲菌（CF—1）发生凝集反应。结论：CJ28KD-31KD外膜蛋白兔抗血清被成功制备，该类蛋白或其中的某些重要组分可能是一种重要的CJ区别其他肠道病原菌的重要目标成分。该类蛋白成分的抗血清的成功制备，将为CJ的诊断血清建立，以及CJ亚单位、基因工程疫苗的研制提供初步的实验依据。

空肠弯曲菌外膜蛋白SDS-PAGE应用于流行病学调查的研究

用SDS-PAGE分析不同来源41株空肠弯曲菌外膜蛋白特征,根据外膜蛋白图谱蛋白带带到组合情况及主带迁移率可将其各分为7个和9个类型.对人源和鸡等动物源菌株外膜蛋白类型的比较,提示鸡等动物是儿童空肠弯曲菌感染的传染源。对腹泻患儿和健康携带者菌株外膜蛋白类型的比较,提示空肠弯曲菌的致病性可能与其外膜蛋白特征有关.用此方法,作者分析了一起幼儿园空肠弯曲菌感染的流行病学关系,结果表明该感染呈散发多源性;人-人传播对空肠弯曲菌感染具有意义.

空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备

目的为获得空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体,用于空肠弯曲菌的检测和研究。方法用空肠弯曲菌ATCC29428株灭活全菌作为抗原,免疫BALB/c小鼠,待抗体水平达到1∶51 200时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0进行融合。同时以粗提天然鞭毛蛋白和人工表达重组鞭毛蛋白包板,用间接ELISA方法筛选,多次克隆化培养后获得的单抗用Western blot进行生物学特性鉴定。结果获得3株持续、稳定分泌抗空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G8、1G9和3F2。结论获得的空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体为建立空肠弯曲菌的蛋白检测及后续研究奠定基础。

空肠弯曲菌蛋白抗原分析

超声粉碎和高速离心获得Ｃ．ｊ－Ｓ１３１ｌｙｓａｔｅ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示位于１０－９２ＫＤ间２４条蛋白条带，薄层扫描发现４３ＫＤ蛋白是菌体最主要成份，其次是１５ＫＤ和１７ＫＤ蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ发现Ｃ。ｊ－Ｓ１３１ｌｙｓａｔｅ中４３ＫＤ蛋白抗原性最强，也最早诱导相应抗体产生。用凝胶过滤和液相制备型等电聚焦分离获得了纯化的９２ＫＤ、４３ＫＤ、１５ＫＤ三种蛋白。本文结果为进一步研究空弯菌诱致自身免疫综合征的分子机理打下了基础。

空肠弯曲菌FliD蛋白的原核表达与抗原性分析

为获得空肠弯曲菌FliD蛋白并分析其抗原性,研究扩增空肠弯曲菌标准菌株11168 fliD基因并构建原核表达质粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化FliD重组蛋白;纯化后的His-FliD蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后收集小鼠血清,间接ELISA结果显示小鼠多抗血清效价为25 600,Westernblot结果显示多抗血清能够与重组蛋白His-FliD特异性结合。研究成功表达空肠弯曲菌FliD蛋白并初步分析其抗原性,为进一步研究空肠弯曲菌与宿主间相互作用及FliD蛋白作为候选亚单位疫苗奠定理论基础。

空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立检测血清中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达获得约47ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。

空肠弯曲菌cjaA基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:原核表达空肠弯曲菌CjaA蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:克隆目的基因并将其构建到pGEX-6p-1和pET30a(+)表达载体,分别以变复性纯化后的rGST-cjaA、rHis-cjaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和mAb腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性。结果:成功构建pET30a(+)-cjaA和pGEX-6p-1-cjaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-cjaA和rGST-cjaA蛋白,Western blot试验显示全菌多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗CjaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2B6、3C2、4F11,其Ig亚类均为IgG1,腹水效价分别为1∶1×105、1∶2×105和1∶4×105;Western blot试验显示,3株mAb均能与表达rHis-CjaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株mAb均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。结论:本研究制备的mAb有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌CjaA蛋白的生物学特性、致病机制,以及建立快速检测技术奠定基础。