穿刺巴斯德菌活体大量繁殖体系的优化

穿刺巴斯德菌Pasteuria penetrans专性寄生于根结线虫Meloidogyne spp.,具有很好的生防潜力。为了进一步提高其产量,本研究比较了5个对南方根结线虫敏感的番茄栽培品种繁殖穿刺巴斯德菌的效率。结果表明,佳粉18和毛粉802繁殖效率最高,单株番茄上的产孢量分别为1.54×108孢子.株-1和1.47×108孢子.株-1。以佳粉18为根结线虫的寄主植物,研究线虫接种量、接种次数、线虫接入时的苗龄及接种后第1周的培养温度对穿刺巴斯德菌活体繁殖量的影响。研究表明,在番茄9片真叶时,每株番茄接种7500条线虫,分3次接入,根粉的产孢量可提高至1.86×108孢子g-1。在18～31℃温度范围内,温度越高,穿刺巴斯德菌对线虫的侵染率越高;31℃时,其孢子侵染率平均达44.57%。

海南省穿刺巴斯德芽菌资源调查及其系统发育分析

穿刺巴斯德芽菌Pasteuriapenetrans是根结线虫的专性寄生菌，是最有潜力的根结线虫生防因子。为了解海南省穿刺巴斯德芽菌资源，本文首次对海南省根结线虫病区进行调查，发现穿刺巴斯德芽菌的分布与土壤类型、寄主植物、气温等因素相关。在获得的27个巴斯德芽菌16SrDNA克隆中，均与穿刺巴斯德芽菌具有较高同源性。其中，菌株wf2与穿刺巴斯德芽菌P．penetrans16SrDNA同源性为95．8％，在发育树上处于独立的分支，为巴斯德芽菌属的1个新种；菌株dal、da2、qh和th与P.penetrans16SrDNA同源性为97．5％~97．8％，在发育树上也处于独立的分支，很可能是巴斯德芽菌属的新种；另22株可归属为穿刺巴斯德芽菌。调查结果反映出海南省具有丰富的巴斯德芽菌资源。

穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3对番茄根结线虫病防效研究

为了探讨穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3对番茄根结线虫病的防效,对种植在含有根结线虫土壤中的番茄根系周围接种不同量的穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3,在接种后的30、45、60 d分别测定番茄的株高、茎粗、根重、地上部重、根冠比、根系活力、病情指数,并在结果期测定单果重和3穗果的单株产量。结果表明:根结线虫侵染会造成番茄株高、产量、地上重显著降低,茎粗明显变细,根重、根冠比显著增加,根重、根系活力先升高后降低。接种穿刺巴斯德芽菌后,各处理的株高、产量、地上部重、茎粗均较只施线虫对照增加,而根重、根冠比则降低,接种穿刺巴斯德芽菌量最多的处理,株高比只接种根结线虫的处理增加6.55%,茎粗增加了16.99%,地上重增加了34.26%,根重减少了13.98%,病情指数降低了64%,果实产量增加了61.56%,与接种根结线虫的处理存在显著差异。这说明穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3对根结线虫具有防治效果,而高接种量的穿刺巴斯德芽菌对番茄根结线虫病的防治效果最好。

穿刺巴斯德芽菌对南方根结线虫活力和存活率的影响

为了探讨南方根结线虫被穿刺巴斯德芽菌吸附后活力和存活率的变化,用穿刺巴斯德芽菌的孢子体外吸附南方根结线虫,每天在显微镜下观察,计数线虫体表的穿刺孢子个数、死亡根结线虫的条数以及存活线虫每分钟扭动的次数,总共观察12d.结果显示,在吸附初期,随着吸附时间的延长,南方根结线虫体表吸附的穿刺孢子数呈递增趋势,但在吸附后9~12d,线虫体表的穿刺孢子数目不再增加;被穿刺巴斯德芽菌吸附后,南方根结线虫的活力先增强,吸附后期活力明显减弱;同时由于穿刺巴斯德芽菌的吸附,南方根结线虫的存活率降低.

穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3对根结线虫侵染的番茄相关生理生化指标的影响

[目的]探讨穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3重寄生在番茄根结线虫中后对番茄的生理生化特性的影响。[方法]对种植在含有根结线虫土壤中的番茄根系周围接种不同量的穿刺巴斯德芽菌Ppgh-3,接种后30、45、60 d分别测定CAT活性、MDA和叶绿素含量。[结果]线虫侵染造成叶片中CAT酶活先升高后降低,根系中CAT活性下降迅速;根系中MDA含量与叶片相反,呈现出先升高,后迅速降低的趋势;叶绿素含量随根结线虫的侵染时间而逐渐降低。[结论]穿刺巴斯德芽菌对根结线虫的重寄生作用,抑制了根结线虫的侵染,从而使保护酶活性升高和下降的幅度变缓,降低了膜脂过氧化作用,维持了细胞膜稳定性并抑制了叶绿素的降解。

根结线虫的发育受穿刺巴斯德氏柄菌抑制的观察

用人工的方法使根结线虫 ( Meloidogynespp.)幼虫被穿刺巴斯德氏柄菌 ( Pasteuria penetrans)孢子附着 ,其中以离心法效果较好 ,但孢子容易脱落。该菌孢子的萌发率为 2 1% ,幼虫被孢子附着后活动力降低。受感染的线虫 (简称阳性线虫 )的发育比未受感染的线虫 (简称阴性线虫 )差 ,其成虫生殖腺长度只及阴性线虫的 1/ 3且较细 ,因而不能产卵 ,也不分泌胶质。该菌的生长经过微菌落、孢子幼体、成熟孢子等阶段 ,在 30 .2℃条件下经 18天 (积温 54 4 .8℃ )开始成熟。

南方根结线虫被穿刺巴斯德芽菌侵染后寿命和生殖相关基因的表达变化

为了探讨南方根结线虫在植物体外被穿刺巴斯德芽菌感染后存活率的变化及感染初期线虫寿命和生殖相关基因的表达情况。首先利用单卵块孵化法对从野外采集的根结线虫进行纯化和分子鉴定。以穿刺巴斯德芽菌孢子体外吸附的南方根结线虫为材料,在显微镜下观察供试线虫的存活情况,每24 h计数一次死亡线虫的条数,总共观察12 d。在被穿刺巴斯德芽菌吸附的第3天收集根结线虫,提取线虫总RNA,采用实时荧光定量PCR检测线虫寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2的表达情况。结果表明:通过分子鉴定确认纯化的根结线虫为南方根结线虫;感染了穿刺巴斯德芽菌的南方根结线虫死亡率显著升高;同时在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫的初期,线虫寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2的表达水平与对照组相比均下调(p<0.05)。这说明穿刺巴斯德芽菌在吸附南方根结线虫的初期能够促使线虫的存活率降低,并抑制其生殖能力,这可能与基因cyp-33、lin-45和mek-2的调控有关。

海南岛胡椒地穿刺巴斯德芽菌鉴定与多样性分析

穿刺巴斯德芽菌(Pasteuria penetrans)是根结线虫(Meloidogyne spp.)的专性寄生菌,且是研究最多的线虫天敌细菌之一。胡椒作为海南的主要经济作物之一,根结线虫发病率较高。前期的研究发现,在海南岛胡椒中较易分离到P.penetrans。结合形态学和16S rRNA序列分析的方法,着重对海南岛6个市县共13个胡椒园进行P.penetrans资源鉴定发现,在经筛选获得的33个具代表性巴斯德芽菌克隆中,32个克隆子被鉴定为P.penetrans,而克隆子tf-1与P.penetransT(AF077672)的相似性仅为97.7%,且在发育树上处于独立分支,可能为巴斯德芽菌属的一个新种。聚类分析结果发现,海南岛存在较丰富的P.penetrans资源,但在不同的地理区域内没有发现明显的种内地域特异性。

穿刺巴斯德芽菌PPh01菌株鉴定及其对根结线虫的寄生性测定

从海南定安胡椒根部根结线虫体上分离到一株细菌PPh01,其形态特征与穿刺巴斯德芽菌相似。16SrDNA序列分析结果表明:该菌株与穿刺巴斯德芽菌的同源性达到99.3%,在发育树上聚为同一分支,亲缘关系最近,鉴定该菌株为穿刺巴斯德芽菌(Pasteuria penetrans)。寄生性试验结果表明:该菌株对南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫的2龄幼虫均具有寄生性和侵染能力。

穿刺巴斯德芽菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

以穿刺巴斯德芽菌16SrDNA片段为靶标,通过对荧光定量PCR反应条件的摸索,建立该菌的荧光定量PCR检测方法。所选靶点最适退火温度60℃,正、反向引物的最佳浓度搭配为900、300nmol/L;以Ct值和质粒拷贝浓度对数为坐标轴建立标准曲线,回归方程为y=-3.200×logx+34.43,R2值为0.998,PCR扩增效率为105.4%,对含穿刺巴斯德芽菌芽胞的土壤样品检测阈值为2×103个/g土壤。该方法敏感度高、特异性好,能够运用于穿刺巴斯德芽菌的定性、定量检测。

穿刺巴斯德芽菌基因组DNA提取方法优化

穿刺巴斯德芽菌(Pasteuria penetrans)是一类形态特殊的革兰氏阳性细菌,其芽胞结构比其他芽胞杆菌属芽胞复杂。本研究以穿刺巴斯德芽菌芽胞为实验对象,探索芽胞破碎条件;并通过比较不同的基因组DNA提取方法,优化穿刺巴斯德芽菌基因组DNA提取方法。实验结果表明,在破碎条件为速率6 m/s时间40 s时,选用粒径为0.1 mm石英砂,芽胞破碎效果最好;利用FG Kit提取的基因组DNA浓度最高(38.30±1.71)ng/μL,可用于后续的巴斯德芽菌基因组学研究。