多囊卵巢综合征颗粒细胞增殖凋亡相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌代谢疾病,是导致育龄期妇女发生排卵障碍,甚至不孕的主要原因,严重影响女性的身心健康。PCOS因其临床表现具有异质性,发病机制目前尚无定论。PCOS患者卵泡发育过程中常表现为颗粒细胞的异常增殖或凋亡,但其机制尚不明确,可能与丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶、核转录因子κB、转化生长因子β/Smads、磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B、Wnt/β⁃连环蛋白等多种信号通路的相互作用有关。本文结合既往研究结果,对上述5条信号通路导致PCOS颗粒细胞异常增殖或凋亡的研究进展进行综述,以期为今后PCOS的治疗提供新的思路。

淫羊藿苷调节SDF-1/CXCR4信号通路对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨淫羊藿苷调节基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXC型趋化因子受体4(CXCR4)信号轴对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法将从PCOS模型组大鼠卵巢组织中成功分离的颗粒细胞分为PCOS组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组、重组大鼠SDF-1蛋白(Rr-SDF-1)组、淫羊藿苷高剂量+Rr-SDF-1组,另取从正常对照组大鼠卵巢组织中成功分离的颗粒细胞作为对照组。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测卵巢颗粒细胞上清液中卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、黄体生成素(LH)水平;CCK-8法、EdU染色检测颗粒细胞增殖;流式细胞术检测颗粒细胞凋亡;Western blot检测颗粒细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、SDF-1、CXCR4蛋白表达。结果与对照组比较,PCOS组FSH水平、光密度(OD)_(450)值、EdU阳性细胞率降低,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平升高(P<0.05)。与PCOS组比较,淫羊藿苷低、中、高剂量组FSH水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率均依次升高,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平均依次降低;Rr-SDF-1组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.05)。与淫羊藿苷高剂量组比较,淫羊藿苷高剂量+Rr-SDF-1组FSH水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率降低,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论淫羊藿苷可能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。

梓醇调节cGAS-STING信号通路对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的:探讨梓醇(Catalpol)通过调节GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激物(cGAS-STING)信号通路对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响。方法:培养肺癌细胞A-427,使用1μmol/L~20μmol/L的梓醇处理细胞,选择最佳药物浓度。将细胞分为对照组(Control组)、梓醇低浓度组(Catalpol-L组,5μmol/L Catalpol)、梓醇中浓度组(Catalpol-M组,10μmol/L Catalpol)、梓醇高浓度组(Catalpol-H组,15μmol/L Catalpol)、梓醇高浓度+cGAS通路抑制剂RU.521组(Catalpol-H+RU.521组,15μmol/L Catalpol+1μmol/L RU.521)。MTT法检测细胞存活率;Edu法检测细胞增殖;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期;蛋白免疫印迹检测Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、cGAS和STING蛋白表达;将CD8^(+)T细胞与各组处理的细胞共培养,台盼蓝染色检测CD8+T细胞存活率;ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β和PD-L1水平。结果:1~20μmol/L的梓醇处理A-427细胞,细胞存活率降低(P<0.05),选择5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的梓醇浓度进行实验。与Control组相比,Catalpol-L组、Catalpol-M组和Catalpol-H组Edu阳性率、细胞克隆形成数、S期细胞占比、IL-4、IL-10、TGF-β和PD-L1水平及Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期和G_(2)/M期细胞占比、CD8^(+)T细胞存活率、IFN-γ水平及Bax、Cleaved-caspase-3、cGAS和STING蛋白水平显著增加(P<0.05),且呈浓度依赖性;与Catalpol-H组相比,Catalpol-H+RU.521组Edu阳性率、细胞克隆形成数、S期细胞占比、IL-4、IL-10、TGF-β和PD-L1水平及Bcl-2蛋白水平显著增加(P<0.05),细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期和G_(2)/M期细胞占比、CD8^(+)T细胞存活率、IFN-γ水平及Bax、Cleaved-caspase-3、cGAS和STING蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:梓醇可能通过激活cGAS-STING信号通路抑制肺癌细胞的增殖和免疫逃逸,促进细胞凋亡。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

沉默信息调节因子1/叉头框蛋白O1信号通路调控铁死亡对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞的影响实验研究

目的:探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头框蛋白O1(FOXO1)信号通路调控铁死亡对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞的影响。方法:将30只雌性SD大鼠分为对照组(皮下注射豆油)和PCOS组(皮下注射脱氢表雄酮)。将对照组和PCOS组大鼠分离得到的卵巢颗粒细胞分为对照组、PCOS组,取一半PCOS组卵巢颗粒细胞为过表达SIRT1组(20μmol/L SIRT1激活剂SRT 2183干预)。RT-qPCR及Western blot检测细胞中SIRT1、FOXO1、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA及蛋白表达。Hoechst染色检测细胞活性氧(ROS)及线粒体活性氧(mtROS)水平。ELISA检测细胞中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe^(2+)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、黄体生成素(LH)水平。流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,PCOS组卵巢颗粒细胞中SIRT1、FOXO1、SLC7A11、GPX4、Bcl-2 mRNA及蛋白表达和GSH、FSH水平降低,Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达和MDA、ROS、mtROS、Fe^(2+)、T、LH水平升高,卵巢颗粒细胞凋亡率增加(均P<0.05)。与PCOS组比较,过表达SIRT1组卵巢颗粒细胞中SIRT1、FOXO1、SLC7A11、GPX4、Bcl-2 mRNA及蛋白表达和GSH、FSH水平升高,Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达和MDA、ROS、mtROS、Fe^(2+)、T、LH水平降低,卵巢颗粒细胞凋亡率减少(均P<0.05)。结论:SIRT1/FOXO1通路在PCOS卵巢颗粒细胞中下调,激活该通路可能通过下调铁死亡抑制PCOS卵巢颗粒细胞凋亡。

miR-215-5p调控YY1通过TGF-β1/Smad信号通路对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探究MicroRNA-215-5p(miR-215-5p)在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠中的表达及其对卵巢颗粒细胞(GC)凋亡的影响,并分析潜在机制。方法采用脱氢表雄酮(DHEA)建立PCOS大鼠模型,分离并培养原代PCOS大鼠卵巢GC,分为对照组(control组)、sh-NC组、sh-YY1组、sh-YY1+LY2109761组、miR-NC组、miR-215-5p mimic组、miR-215-5p mimic+pc-NC组、miR-215-5p mimic+pc-YY1组。TUNEL法检测PCOS大鼠卵巢组织GC凋亡;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢组织/GC中miR-215-5p、阴阳-1(YY1)mRNA表达;CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织/GC中YY1、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad4蛋白表达。结果miR-215-5p在PCOS大鼠卵巢组织中低表达,YY1 mRNA和蛋白水平在PCOS大鼠卵巢组织中显著升高(P<0.05);敲低YY1或上调miR-215-5p可显著增强PCOS大鼠卵巢GC增殖能力,抑制GC凋亡,升高TGF-β1、Smad4蛋白水平(均P<0.05);TGF-β/Smad4信号通路抑制剂LY2109761可显著减弱敲低YY1对卵巢GC凋亡的抑制作用(P<0.05);在过表达miR-215-5p的基础上,上调YY1可抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活,显著减弱miR-215-5p mimic对PCOS大鼠卵巢GC凋亡的抑制作用(P<0.05)。结论miR-215-5p在PCOS中呈低表达,过表达miR-215-5p可能通过下调YY1,激活TGF-β1/Smad信号通路,促进PCOS大鼠卵巢GC增殖并抑制其凋亡。

基于KEGG通路富集分析颗粒酶B-穿孔素选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞凋亡的作用

目的:从分子水平探究颗粒酶B(GRB)-穿孔素(PFP)对选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激人单核巨噬细胞系(TPH-1)模拟急性胰腺炎时巨噬细胞炎症反应,通过CCK8法筛选TNF-α、PFP、GRB的最适浓度;流式细胞仪分别检测对照组、TNF-α组、PFP+GRB组、TNF-α+PFP+GRB组的细胞凋亡情况。将细胞样本分为3组:正常细胞组(NC组)、TNF-α处理组(Treat1组)和TNF-α+PFP+GRB处理组(Treat2组)。提取3组细胞RNA进行转录组学分析,分别通过主成分分析、差异基因分析、富集分析检测各组基因表达情况;选取“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”中的7个差异表达基因(RAB37、GPA33、USH1C、SYTL1、MSRB3、GPER1和CD1B)应用荧光定量PCR验证转录组学分析的准确性。结果:Treat2组与Treat1及NC组相比,细胞凋亡比例显著升高(P<0.05);NC组与Treat1组、Treat2组的差异比较大,显著差异基因较多,而Treat1组与Treat2组的显著差异基因较少,但Treat2组比Treat1组相对于NC组的变化更大;富集分析显示差异基因主要富集于“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”;荧光定量PCR结果显示,所选取的7个差异基因与NC组相比明显下调(P<0.05),和转录组学结果趋势一致。结论:GRB-PFP可选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞的凋亡,并作用于“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”,从而下调细胞因子表达,减轻炎症反应。

基于Trx2/ASK1信号通路探讨补骨颗粒对软骨细胞凋亡的调控机制

目的:观察补骨颗粒对软骨细胞凋亡及对Trx2/ASK1/Caspase-3表达的影响,从而探讨补骨颗粒对软骨细胞凋亡影响机制,为进一步研究补骨颗粒防治骨关节炎奠定实验基础。方法:将20只SD大鼠随机分为空白对照组,补骨颗粒低、中、高剂量组,每组5只。适应性喂养7 d,空白对照组给予蒸馏水2 m L·kg^(-1)灌胃,补骨颗粒低、中、高剂量组给予补骨颗粒1.54 g·kg^(-1)、3.08 g·kg^(-1)、6.16 g·kg^(-1)灌胃。干预14 d后,抽取血液经离心获得血清。通过酶联免疫吸附试验检测血清中Trx2、ASK1、Caspase-3表达量,采用MTT法检测血清干预后的细胞增殖活性,采用流式细胞仪检测血清干预后的软骨细胞凋亡率。结果:与空白对照组比较,补骨颗粒低、中、高剂量组Trx2、ASK1与Caspase-3含量明显减少,差异均有统计学意义(P <0.05);与补骨颗粒中剂量组比较,补骨颗粒低剂量组和高剂量组Trx2与ASK1含量明显增多,补骨颗粒低剂量组Caspase-3含量明显增多,差异均有统计学意义(P <0.05)。与空白对照组比较,补骨颗粒低、中、高剂量组OD值明显升高(P <0.05);补骨颗粒低、中、高剂量组组间比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。流式细胞仪检测发现,不加入硝普钠时(对照组1)软骨细胞的凋亡率最低为4.25%,加入硝普钠后(空白对照组1)软骨细胞的凋亡率变为46.86%,补骨颗粒低剂量组1软骨细胞的凋亡率(30.15%)高于补骨颗粒中剂量组1(27.77%)和高剂量组1(27.41%)。结论:补骨颗粒将会调控Trx2表达,并且不同剂量补骨颗粒将会通过Trx2-ASK1解离度调控Caspase-3活化程度而影响软骨细胞的凋亡,这将有助于进一步认识补骨颗粒对骨关节炎防治过程。

口腔扁平苔藓局部浸润淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素蛋白表达与上皮细胞凋亡的关系

目的检测口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)上皮细胞凋亡状况,观察颗粒酶B、穿孔素在OLP固有层浸润淋巴细胞中的蛋白表达,探讨细胞毒作用对OLP上皮细胞凋亡的影响。方法采用原位缺口末端DNA标记技术,定位检测OLP上皮细胞凋亡情况;分别使用免疫组化法检测颗粒酶B和穿孔素在组织总淋巴细胞以及CD8+细胞中的表达,以健康口腔黏膜组织(NOM)作对照。结果与NOM相比,OLP上皮细胞凋亡显著增加(P=0.037);OLP淋巴细胞中颗粒酶B、穿孔素表达明显增强(P值分别为0.016和0.012),其部分阳性细胞接近上皮基底层。OLP中CD8+/颗粒酶B+细胞双阳性表达和CD8+/穿孔素+细胞双阳性表达较NOM明显升高(P值分别为0.043和0.032)。OLP上皮细胞凋亡与淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达成正相关(r=0.56,P=0.038;r=0.42,P=0.041)。结论 OLP浸润淋巴细胞包括CD8+T细胞中颗粒酶B、穿孔素表达增强,提示OLP淋巴细胞可能以颗粒酶B、穿孔素作为细胞毒介质攻击口腔上皮细胞引起其凋亡。

黄芩苷对多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨黄芩苷对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路的调节作用。方法48只大鼠成功建立PCOS模型,并随机分为模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组,每组12只,另取12只大鼠作为对照组。黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组大鼠分别灌胃25、50 mg∙kg^(−1)黄芩苷,阳性对照组大鼠灌胃0.3392 mg∙kg^(−1)炔雌醇环丙孕酮片(达英-35),对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,每日1次,连续3周。用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immuno⁃sorbent assay,ELISA)检测黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、睾酮(testos⁃terone,T)以及雌二醇(estradiol,E2)含量;用HE染色观察卵巢组织病理损伤,细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测颗粒细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测PI3K、磷酸化磷脂肌醇3-激酶(phospho PI3K,p-PI3K)、Akt以及p-Akt蛋白相对表达量。结果对照组大鼠可见黄体,未见囊状扩张卵泡;模型组大鼠卵巢体积变大,少见黄体,可见囊状扩张卵泡;黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组大鼠卵巢体积变小,可见黄体,囊状卵泡扩增不明显。与对照组比较,模型组FSH和E2水平、颗粒细胞存活率以及p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达量降低,LH、T水平和颗粒细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组FSH、E2水平,颗粒细胞存活率及p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达量升高,LH、T水平及颗粒细胞凋亡率降低,其中阳性对照组各指标水平变化最显著,其次是黄芩苷高剂量组(P<0.05)。结论黄芩苷可促进PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖,抑制凋亡,改善卵巢组织病理损伤,其可能是通过激活PI3K/Akt信号通路发挥作用的。

经皮穴位电刺激对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制

目的 探讨经皮穴位电刺激(TEAS)对早发性卵巢功能不全(POI)大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。方法 将40只SPF级SD雌性大鼠按照随机数字表法分成4组,对照组、模型组、TEAS组和激素组。除对照组外,其余各组均使用雷公藤多苷片连续灌胃14 d建立POI大鼠模型。造模成功后,TEAS组给予电子针疗仪刺激20 min,1次/d,共干预2周;激素组给予戊酸雌二醇溶液1 mg/(kg·d)灌胃,对照组和模型组仅给予相同时间的抓取和固定,不予任何治疗。采用酶联免疫吸附试验检测大鼠血清卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E_(2))、抗米勒管激素(AMH)水平,TUNEL检测卵巢颗粒细胞凋亡情况,Western blot法检测卵巢组织微小RNA-23a(miR-23a)、SMAD同源物5(SMAD5)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠血清E_(2)、AMH水平降低,FSH水平升高(P<0.05);颗粒细胞凋亡率均升高(P<0.05);与模型组比较,TEAS组及激素组大鼠血清E_(2)、AMH水平均升高,FSH水平均降低,颗粒细胞凋亡率均下降(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠卵巢SMAD5蛋白表达减少,而mi R-23a、Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05);与模型组比较,TEAS组及激素组大鼠卵巢SMAD5蛋白表达增加,mi R-23a、Caspase-3蛋白表达减少(P<0.05)。结论 TEAS能够有效调节POI模型大鼠血清激素水平,可能通过mi R-23a/SMAD5信号通路,下调凋亡调控蛋白Caspase-3的表达,从而减少颗粒细胞的过度凋亡,改善卵巢功能。

补肾生精调和气血法调控Bcl-2相关线粒体凋亡信号通路改善大鼠卵巢储备功能的研究

【目的】探讨补肾生精调和气血法对卵巢储备功能减退(DOR)模型大鼠的干预机制。【方法】将60只性成熟雌性SD大鼠随机分为正常组,模型组,西药组,中药低、中、高剂量组,每组10只。除正常组,其余各组大鼠给予单次腹腔注射环磷酰胺构建DOR模型。于造模次日开始,西药组给予戊酸雌二醇0.105 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,中药低、中、高剂量组分别对应给予补肾生精调和气血法中药复方8.075、16.15、32.3 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,正常组、模型组给予等体积去离子水灌胃,每日1次,连续21 d。给药结束后,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)水平,采用电化学发光法检测血清雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)水平,采用Western Blot法检测卵巢组织血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)的蛋白表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测卵巢组织HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达水平。【结果】与正常组比较,模型组血清FSH、LH水平升高,E2、AMH水平降低,卵巢组织HO-1、NQO-1、Bcl-2蛋白表达水平下调,Bax、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白表达水平上调,Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平下调(均P<0.05);与模型组比较,西药组和中药低、中、高剂量组上述各指标得到一定程度的改善,且中药各剂量组各指标的改善效果与西药组相当。【结论】补肾生精调和气血法通过调控Bcl-2相关线粒体凋亡信号通路,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,改善大鼠卵巢储备功能。

穿孔素与颗粒酶B在乙型肝炎不同免疫状态中的作用

穿孔素(perforin,PFN)是存在于细胞毒性细胞[又称杀伤细胞,包括自然杀伤(natural killer,NK)细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL)等]的糖蛋白,颗粒酶(granzyme,Gzm)B是表达于杀伤细胞的小分子蛋白质。PFN和Gzm B贮存在细胞毒性细胞的胞浆颗粒中,在与靶细胞接触后通过胞吐而释放。作为细胞毒性细胞所具有的2类重要效应分子,PFN和Gzm B在各种类型肝损伤免疫反应中发挥重要作用。在造成肝损伤的众多原因中,对乙型肝炎所致肝损伤研究较多。HBV复制与宿主抗病毒免疫的相互作用决定了HBV感染的最终结果,PFN和Gzm B是病毒感染的病原清除和靶细胞凋亡重要的介导物质,在HBV感染的不同阶段,PFN和Gzm B表达水平呈现不同特点:在急性HBV感染期,CTL高表达PFN、Gzm B;在慢性HBV感染期,NK细胞、CTL表达PFN、Gzm B呈下调趋势;在重症乙型肝炎阶段,CTL表达PFN、Gzm B的上调可能参与HBV感染重症化。本文主要对HBV感染免疫阶段PFN和Gzm B在不同免疫状态中具体作用特点作一介绍。

尼古丁抑制穿孔素/颗粒酶B诱导的A549肺癌细胞凋亡

目的:首次探讨尼古丁对穿孔素/颗粒酶B(perforin/granzyme B)诱导的A549肺癌细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:以人肺癌细胞株A549为研究对象,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化,异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)染色后流式细胞术定量检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)及存活素(survivin)mRNA的表达量。结果:(1)不同浓度尼古丁单独作用A549细胞时未见明显诱导凋亡现象,可显著抑制细胞生长(P<0.01),其抑制率与作用时间和剂量呈正相关。(2)0.125 mg/L perforin作用于A549细胞(1×106个)时,PI染核率可达到90%以上。而当加入1μL granzyme B(1 mg/L)孵育6 h时,perforin/granzyme B组细胞可呈现90%以上的凋亡现象。(3)6μmol/L尼古丁作用于perforin/granzyme B预处理的细胞6 h时可见明显凋亡抑制现象,当检测其凋亡抑制蛋白XIAP和survivin mRNA的含量时,发现尼古丁组表达量较高,perforin/granzyme B组表达量明显降低,而当尼古丁联合perforin/granzyme B时表达量最高。结论:尼古丁可明显抑制perforin/granzyme B诱导的A549肺癌细胞凋亡现象,这种作用可能与凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的表达上调有关。

诱导型一氧化氮合酶反义核酸在脊髓损伤后细胞凋亡和p-p38 MAPK信号转导通路中的作用

目的研究一氧化氮合酶(NOS)反义核酸(ASODN)对脊髓损伤后NOS表达、细胞凋亡、信号转导通路的影响。方法设计并合成诱导型NOS反义寡脱氧核苷酸(ASODN-iNOS)及诱导型NOS无义寡脱氧核苷酸(NSODN-iNOS),微量注入大鼠蛛网膜下腔并制备成脊髓压迫伤动物模型。伤后6 h分别用RT-PCR检测iNOS mRNA表达及用Western blotting检测组织中磷酸化丝裂原激活蛋白激酶(p-p38 MAPK)的变化,用双标染色流式细胞术检测伤后72 h细胞凋亡情况。损伤对照组鞘内注射不含核酸的溶液成分。结果脊髓损伤后组织中存在iNOS的表达和p-p38 MAPK变化;损伤后局部组织中存在明显的细胞凋亡;ASODN-iNOS可以抑制iNOS的表达,并可以显著抑制损伤后p-p38 MAPK的表达和细胞凋亡的发生,与损伤对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论ASODN-iNOS可以抑制脊髓损伤后iNOS的表达和细胞凋亡,ASODN的这种作用可能与p-p38 MAPK信号转导通路有关。

复方地黄颗粒对阴虚动风证帕金森病大鼠纹状体细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨复方地黄颗粒(CRG)对阴虚动风证帕金森病(PD)大鼠纹状体细胞凋亡及对PI3K/Akt信号通路的影响。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射损毁黑质法制备阴虚动风证PD大鼠模型,造模成功30只大鼠。随机分为模型组、美多芭(MAD)组、复方地黄颗粒低(L-CRG)、中(M-CRG)、高(H-CRG)剂量组,每组6只。另纳入正常对照组和假手术组各6只。美多芭组予美多芭150 mg/(kg·d)灌胃; L-CRG、M-CRG、H-CRG组予复方地黄颗粒3. 5 g/(kg·d)、7 g/(kg·d)、14 g/(kg·d)灌胃;正常对照组、假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃。用药6周后处死大鼠,取纹状体。采用TUNEL法检测纹状体细胞凋亡情况;采用透射电子显微镜观察纹状体细胞超微结构;采用蛋白印迹(WB)法检测Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平。结果与对照组和假手术组比较,模型组细胞凋亡指数明显升高,差异有统计学意义(P <0. 05),细胞凋亡特征明显,Bax蛋白水平明显升高(P <0. 05),Bcl-2、PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P <0. 05);与模型组比较,低中高剂量复方地黄颗粒组细胞凋亡指数显著下降(P <0. 05),细胞形态趋于正常,Bax蛋白水平明显降低(P <0. 05),Bcl-2、PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P <0. 05),且呈剂量依赖效应。结论复方地黄颗粒可能通过PI3K/Akt信号通路调节凋亡相关蛋白表达,抑制阴虚动风证PD大鼠纹状体细胞凋亡,呈剂量依赖效应。

干扰CLDN6基因表达通过调控MAPK/ERK信号通路对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨Claudin-6(CLDN6)在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠中的表达及其对卵巢颗粒细胞(GC)增殖与凋亡的影响和可能作用机制。方法SD雌性大鼠皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)诱导建立PCOS模型,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测卵巢组织中CLDN6表达。分离培养原代PCOS大鼠卵巢GC,采用小分子干扰RNA(siRNA)技术和pcDNA3.1质粒转染下调/上调卵巢GC中CLDN6表达水平,RT-qPCR检测转染效果;CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和凋亡;Western blot法检测细胞CLDN6、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路和增殖、凋亡相关蛋白的表达。结果CLDN6在PCOS大鼠卵巢组织和GC中呈高表达。转染后,与空白组相比,对照组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平、GC活性、Cyclin D1、Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达显著升高,凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05);与对照组相比,si-CLDN6组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平、GC活性、Cyclin D1、Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达显著降低,凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),pcDNA3.1-CLDN6组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平、GC活性、Cyclin D1、Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达显著升高,凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05);上调CLDN6表达基础上,ERK1/2抑制剂PD98059可明显减弱CLDN6高表达对GC增殖的促进作用和GC凋亡的抑制作用。结论CLDN6在PCOS大鼠卵巢组织和GC中呈高表达,下调CLDN6可抑制PCOS大鼠卵巢GC增殖并诱导GC凋亡,其作用机制可能与抑制MAPK/ERK信号通路有关。

抗衰老酶1-p53信号通路在右美托咪定对大鼠海马神经元细胞凋亡保护作用中的机制分析

目的分析抗衰老酶1(SIRT1)-p53信号通路在右美托咪定对大鼠海马神经元细胞凋亡保护作用中的机制。方法选取10只出生24 h内的无特定病原体级SD大鼠,取原代海马神经元。(1)分别使用1μmol/L(A组)、5μmol/L(B组)、50μmol/L(C组)的右美托咪定对原代海马神经元进行2 h处理,并设置对照组1给予2 h的50%氧气处理。对A组、B组、C组及对照组1的原代海马神经元细胞内Bax、剪切型半胱氨酸蛋白酶(c-caspase-3)及剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(c-PARP)、磷酸化组蛋白H2A家族成员X(γ-H2AX)、SIRT1及p53蛋白表达水平及细胞凋亡情况进行观察和比较。(2)右美托咪定麻醉前24 h分别给予50μmol/L的sirtinol(a组)、50μmol/L的salermide(b组)、100μmol/L的resveratrol(c组)处理原代海马神经元,然后使用50μmol/L的右美托咪定进行2 h处理,并设置对照组2给予24 h的0.9%氯化钠溶液处理。观察并比较激活或抑制SIRT1通路对麻醉引起原代海马神经元细胞凋亡Bax、c-caspase-3、c-PARP、γ-H2AX、SIRT1、p53蛋白水平的影响。结果A组、B组、C组原代海马神经元细胞的A值和细胞存活率水平均低于对照组1,C组最低,A组、B组、C组原代海马神经元细胞凋亡率均高于对照组1,C组最高,与右美托咪定的浓度呈现剂量反应,差异均有统计学意义(P<0.05)。A组、B组、C组原代海马神经元细胞中Bax、c-caspase-3及c-PARP的表达水平均高于对照组1,C组最高,与右美托咪定的浓度呈现剂量反应,差异均有统计学意义(P<0.05)。A组、B组、C组原代海马神经元细胞中γ-H2AX、SIRT1蛋白的表达水平均高于对照组1,C组最高;p53蛋白的表达水平均低于对照组1,C组最低,与右美托咪定的浓度呈现剂量反应,差异均有统计学意义(P<0.05)。SIRT1拮抗剂预处理可下调SIRT1蛋白表达,上调p53乙酰化,增加Bax、c-caspase-3、c-PARP及γ-H2AX的表达;SIRT1激动剂预处理可上调SIRT1蛋白表达,抑制p53的乙酰化水平,降低Bax、c-caspase-3、c-PARP及γ-H2AX蛋白表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论右美托咪定诱导的麻醉激活SIRT1-p53信号通路诱导海马神经元凋亡,右美托咪定诱导麻醉中可合理使用SIRT1激动剂以保护神经功能,且随右美托咪定剂量升高保护作用效果更明显。

双乌宣痹颗粒对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的观察双乌宣痹颗粒对类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞(FLS)凋亡及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响,探讨其作用机制。方法胶原酶消化法分离RA患者膝关节FLS,传代培养并鉴定后,取4～7代细胞用于实验。RA-FLS分别用高[17.28g/(kg.d)]、中[8.64g/(kg.d)]、低[4.32g/(kg.d)]剂量双乌宣痹颗粒含药血清培养24h,即高、中、低剂量双乌宣痹组;另设阳性药物对照[来氟米特,1.04mg/(kg.d)]组和阴性对照(生理盐水)组。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blotting检测PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。结果高、中、低剂量双乌宣痹含药血清及来氟米特含药血清均能明显促进FLS的凋亡,下调PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白表达,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);与来氟米特组比较,高、中双乌宣痹组PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白的表达明显下调,Bax蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论双乌宣痹含药血清能促进RA-FLS凋亡,下调Bcl-2、PI3K、p-Akt蛋白的表达,这可能是其治疗RA的机制之一。

补肾方药通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制思考

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)作为常见的生殖内分泌疾病,危害女性的生殖健康和生活质量。研究发现POI的发病机制与卵巢颗粒细胞过度凋亡相关。颗粒细胞过度凋亡会使卵泡提前闭锁,导致卵巢功能下降。同时,PI3K/Akt/NF-κB信号通路及凋亡蛋白参与凋亡过程。补肾方药能够抑制颗粒细胞凋亡,改善卵巢功能,临床疗效显著,并且对PI3K/Akt/NF-κB信号通路有调控作用。因此,本文结合相关文献报道,推测补肾方药可能通过调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制卵巢颗粒细胞凋亡治疗POI,为基础研究及临床诊疗提供思路与方法。