穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及表达

[目的]克隆并表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因。[方法]将穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。[结果]重组酵母菌在0.5%甲醇中培养144 h后,所提取的酶蛋白具有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为58 kD。[结论]穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因得到了表达。

羊肝源穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶的分离及其动力学特性

对羊肝中含有的水解穿山龙薯蓣皂苷鼠李糖糖基的穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶进行了分离、纯化，并对其动力学特性进行了研究．结果表明，粗酶液经DEAE—Cellulose离子交换层析柱纯化后，其比活提高了19．9倍．在pH=6．8、反应温度为42℃、反应时间为8h和底物浓度为23mmol／L的条件下，该酶达到其最高活力．在10～200mmol／L范围内，Fe^2＋和Cu^2＋对酶活力有明显的抑制作用，Mg^2＋和Zn^2＋对酶活力有微弱的激活作用，而Ca^2＋对酶有较强的激活作用．采用SDS—PAGE方法测得酶蛋白分子量为71000．选择穿山龙薯蓣皂苷、人参皂苷Re和芦丁为酶反应底物，进行酶的底物专一性研究发现，穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶对其底物具有高度专一性．

微生物薯蓣皂苷糖苷酶的分离纯化的研究

产薯蓣皂苷酶的sp.s00c菌发酵液,通过分级沉淀的分离方法,经离子交换柱提纯分离,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳单点的酶,其酶蛋白分子量为59 ku,提纯酶最适酶反应温度为40℃,最适pH值为5.0。提纯酶不仅能水解薯蓣皂苷的鼠李糖基,也能水解薯蓣皂苷的葡萄糖基。

穿山龙薯蓣皂苷通过调控自噬治疗胶原诱导性关节炎小鼠模型的机制

目的探讨穿山龙薯蓣皂苷通过自噬治疗胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠的作用机制。方法通过鸡Ⅱ型胶原乳剂建立CIA模型小鼠,初次免疫DBA1小鼠(0.1 mL),第21天后再次给予相同剂量刺激。加强免疫后将胶原免疫的50只小鼠随机分组为CIA模型组、雷公藤组和穿山龙薯蓣皂苷低、中、高剂量组,另有10只小鼠注射等量生理盐水作为对照组。在对小鼠进行连续14天灌胃治疗并观察各组小鼠足爪的炎症程度,取下各组小鼠脾、腹股沟淋巴结和踝关节、膝关节,对踝关节、膝关节进行HE染色,检测各组淋巴结、脾组织中mRNA和蛋白质水平的相关自噬指标。结果与CIA模型组相比,穿山龙薯蓣皂苷高剂量组关节炎指数(AI)评分降低(P<0.05);雷公藤组及穿山龙薯蓣皂苷组足爪厚度差值减小(P<0.01)。与对照组相比,CIA模型组体质量明显下降(P<0.01);小鼠膝关节滑膜和足爪踝关节HE染色结果显示CIA模型组对比对照组出现免疫细胞浸润、骨质侵蚀、软骨破坏和滑膜增生的症状;雷公藤组与穿山龙薯蓣皂苷中、高剂量组对CIA模型有不同程度的治疗作用,可以减轻和预防症状。与CIA模型组相比,雷公藤组和穿山龙薯蓣皂苷治疗组中LC3、Beclin-1的mRNA水平和蛋白水平的表达升高,p62的mRNA水平和蛋白水平的表达降低。结论穿山龙薯蓣皂苷可能通过抑制自噬对CIA模型小鼠起到治疗作用。

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的序列进行了调取。根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3′RACE(Rapid-Amplification of cDNA 3′Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3′端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp。这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3′末端的序列的调取提供了参考。

薯蓣皂苷糖苷酶基因的克隆及同源性分析

[目的]从分子生物学水平上研究Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶,对该酶基因CDS区的序列进行调取和分析。[方法]根据薯蓣皂苷糖苷酶的N端序列设计简并引物,以总RNA为模板进行RT-PCR调取cDNA,然后采用3'RACE和5'RACE技术,调取CDS区基因全序列。[结果]测序得到序列长度为1 497 bp。该基因的同源性比较分析表明,薯蓣皂苷糖苷酶基因与α-鼠李糖苷酶没有同源性,与α-淀粉酶的基因序列具有很高的同源性,达到93%以上。[结论]蛋白质结构存在差异,酶反应特性不同。

RP-HPLC法测定穿山龙中薯蓣皂苷的含量

目的:建立反相高效液相色谱法测定穿山龙中薯蓣皂苷的含量。方法:采用Hypersil C18(ODS2)色谱柱,乙腈-水(54:46)为流动相,流速1.0 mL·min-1,紫外检测波长为210 nm。结果:薯蓣皂苷可与其他主要成分分离,薯蓣皂苷与峰面积呈良好的线性关系,线性范围为2.3-11.5μg,r=0.9999;样品平均回收率为98.6%,RSD为1.0%(n=5)。结论:本方法用反相高效液相色谱法直接测定了全国6个地区共8个批次的穿山龙中薯蓣皂苷的含量。该方法无需衍生化,分离效果好,分析快速、准确,灵敏度高,重现性好。

超临界CO_2萃取穿山龙中薯蓣皂苷元的研究

目的 研究超临界CO2 萃取穿山龙中薯蓣皂苷元的工艺。方法 探讨了萃取压力、萃取温度、萃取时间、携带剂类型及携带剂含量等因素对薯蓣皂苷元收率的影响 ,确定了超临界CO2 萃取穿山龙中薯蓣皂苷元的最佳条件 ,并将超临界CO2 萃取法与传统的有机溶剂提取法进行了比较。结果 萃取穿山龙中薯蓣皂苷元的最佳超临界萃取条件 :萃取压力 35 .0MPa,萃取温度 4 5℃ ,选择体积分数为 95 %乙醇为携带剂 ,携带剂含量为 3% ,萃取时间 3.0h ,CO2 流速 2L·min-1。结论 超临界CO2萃取法萃取薯蓣皂苷元比传统提取方法收率及纯度均高 ,且安全高效。

穿山龙中薯蓣皂苷酶提取工艺的优化

目的优化穿山龙中薯蓣皂苷酶提取工艺。方法以薯蓣皂苷提取率为评价指标,单因素试验考察酶解时间、酶解温度、酶解pH、液料比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数,再通过响应面法优化提取工艺。结果最佳条件为酶解温度44℃,酶解pH 4.9,酶解时间1.9 h,液料比9∶1,薯蓣皂苷提取率为4.757%,与预测值(4.764%)接近。结论该方法合理、准确、可靠,可用于酶提取穿山龙中的薯蓣皂苷。

穿山龙提取物薯蓣皂苷对糖尿病模型大鼠血清HA和5-HT的影响

目的:探讨中药穿山龙提取物薯蓣皂苷对糖尿病大鼠血清组胺(HA)和5-羟色胺(5-HT)的影响,以期为后期痛性糖尿病周围神经病变(DPN)的研究奠定理论基础。方法:以2%链脲佐霉素溶液诱发糖尿病,将造模成功的大鼠,随机分为干预2周、4周、8周的模型组、薯蓣皂苷组和强的松组,另取24只血糖正常的大鼠分为各时期正常组,分别灌胃相应药物或生理盐水后用Elisa法观察不同时期各组大鼠血清HA和5-HT的蛋白表达。结果:模型组治疗各时期血清HA和5-HT表达均明显高于正常组(P<0.01),薯蓣皂苷组和强的松组大鼠治疗各时期上述指标明显低于模型组(P<0.01),其中薯蓣皂苷组干预效果明显高于强的松组(P<0.01)。结论:中药穿山龙提取物薯蓣皂苷可改善糖尿病(DM)大鼠血清致痛物质的表达,疗效强于强的松。

RP-HPLC法同时测定穿山龙中薯蓣皂苷和纤细皂苷的含量

目的建立测定不同产地穿山龙供试品中薯蓣皂苷和纤细皂苷含量的方法。方法采用RP-HPLC法。色谱柱为Kromasil C8色谱柱（200 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为乙腈-水（体积比41∶59）,检测波长为206 nm,柱温为室温。结果薯蓣皂苷质量浓度在0.10~1.00 g.L-1内、纤细皂苷质量浓度在0.02~0.20 g.L-1内与峰面积呈现良好的线性关系,相关系数均为0.9997（n=6）。其平均回收率分别为101.2%、100.7%,RSD分别为2.4%、2.0%（n=9）。供试品含量测定结果表明,饮片中薯蓣皂苷和纤细皂苷的含量显著高于新鲜药材烘干品。结论该方法简便、准确、重现性好,为穿山龙药材的质量控制提供了参考。

测定穿山龙中薯蓣皂苷元的前处理方法的改进

目的研究一种测定穿山龙中薯蓣皂苷元时快速提取薯蓣皂苷元的新方法——水解原位萃取法。方法对影响提取率的重要因素进行了考察,以期建立最佳提取条件和适宜的纯化方法。结果样品用含约1.5 mol·L-1硫酸的70%异丙醇水溶液在沸水浴中加热回流4 h,获得了比传统方法更高的提取率。结论水解原位萃取法简单、省时、准确。

穿山龙中薯蓣皂苷元的提取分离及测定方法研究概况

对穿山龙中薯蓣皂苷元的提取分离方法及其含量测定方法作一综述,并作以比较分析。

高效液相色谱法测定穿山龙中薯蓣皂苷元的含量

目的:采用高效液相色谱法测定中药材穿山龙中薯蓣皂苷元的含量。方法:高效液相色谱法,十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Alltima C_(18)(150mm×4.6mm,5μm),甲醇-水(84:16)为流动相,流速:1mL·min^(-1),检测波长为203nm,柱温:25℃。结果:薯蓣皂苷元1.28～13.10μg范围内色谱响应线性关系良好,r=0.9995,回归方程为 Y=1.550×10~4X+396.7。仪器精密度的 RSD 为1.6%,方法重复性的 RSD 为0.94%。平均回收率为97.7%,RSD=0.60%(n=6)。结论:本法快速简便,重复性好,测定准确灵敏。

穿山龙提取物薯蓣皂苷对TNBS诱导的IBS大鼠VIP表达的作用

目的:探讨血管活性肠肽在三硝基苯磺酸诱导的肠易激综合征大鼠中的表达量及中药穿山龙提取物薯蓣皂苷的干预作用。方法:TNBS诱导大鼠肠易激综合征模型,第2、7、14和28天对大鼠体质量、髓过氧化物酶活力、疼痛阈值、VIP含量进行测定。结果:TNBS诱导的肠易激综合征大鼠体质量降低,髓过氧化物酶活力增加,疼痛阈值降低,模型大鼠中性粒细胞内炎症标记物过氧化物酶的表达比正常大鼠明显升高,证实TNBS处理后诱导了大鼠的炎症,TNBS处理大鼠后血浆VIP浓度比对照组显著增加(P<0.05),穿山龙提取物薯蓣皂苷处理后显著下调。结论:VIP表达的改变在肠易激综合症中可能起着重要作用,穿山龙提取物中药薯蓣皂苷对TNBS诱导的IBS大鼠具有治疗作用。

反相高效液相色谱法分析穿山龙中薯蓣皂苷元的含量

目的:建立测定穿山龙中薯蓣皂苷元含量的反相高效液相色谱法,从而为控制穿山龙的质量提供参考。方法:采用双相酸水解法提取穿山龙中的薯蓣皂苷元;使用 Agilent Zorbax 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-水(94:6)为流动相,检测波长为203 nm,流动相流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为40℃。结果:样品中的薯蓣皂苷元可以与各干扰组分达到基线分离;用本法测定薯蓣皂苷元的线性范围为1.055～21.10 μg;重复性试验(n=6)RSD=1.7%;平均回收率(n=6)达到96.8%,RSD=1.5%;试验中测得穿山龙中薯蓣皂苷元的平均含量(n=6)为1.61%,RSD=1.7%。结论:本方法具有供试品溶液制备简便,检测灵敏,线性范围宽,重复性好等优点,适合于穿山龙中薯蓣皂苷元的含量测定。

不同产地穿山龙中薯蓣皂苷元比较

目的比较不同产地穿山龙Dioscorea nipponica Makino中薯蓣皂苷元的含有量。方法采用加压液体萃取法获得薯蓣总皂苷,并利用加压两相酸水解法制备供试品溶液。穿山龙50%乙醇提取物的分析采用Waters SunFire RP18柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相乙腈-水;体积流量1.0 mL/min;检测波长203 nm;柱温30℃。结果通过新方法制备所得的供试品溶液中薯蓣皂苷元的平均含有量比传统方法高出18%。薯蓣皂苷元在10.94~1 400μg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 5),平均加样回收率96.88%~103.0%,RSD<3%,平均含有量0.695%~2.263%。结论不同产地穿山龙中薯蓣皂苷元的含有量差异很大,其中产于黑龙江伊春的最高,且东北三省产的远高于其他产地。

两种菌产皂苷糖苷酶的性质比较

对微生物Absidiasp．D0d菌产的薯蓣皂苷糖苷酶（RhaD）和微生物Absidiasp．A3r菌产的黄芪皂苷糖苷酶（RhaA）进行了分离纯化，并对它们的酶性质做了比较。RhaD的分子质量是59ku，最适反应pH是5．0，pH稳定范围是3．O～8．0；最适反应温度是40℃，在60℃以下稳定。金属离子Na＋、K＋对酶反应基本没有影响，Mg2＋、Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋、Fe2＋对酶反应有抑制作用。酶反应动力学参数K。为19．26mmol／L，Vmax为1．23mmol／（L·h）。RhaA的分子质量是54ku，最适反应pH是5．0，pH稳定范围是3．O～6．0；最适反应温度是40℃，在60℃以下稳定，Mg2＋和Ca2＋对RhaA的酶反应没有影响，Fe3＋、Cu2＋的抑制作用较为明显。酶反应动力学参数Km为17．86mmol／L，Vmax为1．18mmol／（L·h）。RhaD只能水解与穿山龙薯蓣皂苷母环结构相似的异螺甾烷醇型的皂苷上的α-鼠李糖，不能水解pNP-α-L—Rha。RhaA仅水解四环三萜环阿屯烷型的黄芪皂苷16上的α-鼠李糖，不能水解pNP—α—L-Rha。

穿山龙提取物薯蓣皂苷对痛性糖尿病周围神经病变大鼠钠通道基因表达的影响

目的：观察穿山龙提取物薯蓣皂苷对痛性糖尿病周围神经病变大鼠Nav 1. 7通道mRNA表达的影响。方法：SPF级雄性Wistar大鼠80只,随机取14只为正常对照组,其余大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素STZ（53 mg/kg）造模,72 h后测大鼠尾静脉血血糖〉 16. 7 mmol/L作为观察对象,持续喂养2周,将60只成模大鼠随机分为模型组,薯蓣皂苷高、低剂量组,强的松组,分别于药物治疗后第4、8周,采用实时荧光定量PCR法检测大鼠坐骨神经Nav 1. 7mRNA表达情况。结果：与同期模型组比较,各治疗组大鼠坐骨神经Nav 1. 7mRNA表达水平下调（P 〈0. 01）,低剂量组较同期高剂量组Nav 1. 7mRNA表达上调（P 〈0. 01）,强的松组与同期低剂量组比较,坐骨神经Nav 1. 7mRNA表达水平下调（P 〈0. 05）。结论：薯蓣皂苷可以减轻PDPN大鼠坐骨神经的损伤。