含人自噬基因hAPG12穿梭载体构建及其在酵母自噬中的作用

目的该研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,将构建好的载体转化到酵母菌内,以此研究hAPG12在酵母自噬过程中的作用。方法从pEGFP-C2-hAPG12中扩增出EGFP-hAPG12融合基因,鉴定正确后定向亚克隆到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA中,构建载体pESC-URA-EGFP-hAPG12并将其转化到酵母,荧光显微镜下观察,用自噬诱导剂诱导酵母自噬以观察hAPG12在酵母内的表达定位。结果证实EGFP-hAPG12基因已完全正确亚克隆到pESC-URA中,荧光显微镜观察结果证明EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中成功表达,以诱导培养24h的荧光最强,EGFP-hAPG12定位于酵母的自噬体中。结论成功构建了具有报告基因的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12;EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中得到表达,hAPG12在酵母自噬体形成过程中起作用。

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒穿梭质粒的构建

为研制FMD复制缺陷型腺病毒活载体疫苗,通过RT-PCR方法获得了O型口蹄疫病毒(FMDV)全开放阅读框(ORF)基因片段,将其克隆到pMD18-T载体后测序,再将ORF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定,所克隆的ORF编码基因序列与原始强毒株Akesu/58的ORF编码基因比较,L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98.8%、97.9%、99.0%和97.6%,PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6.9 kb的目的基因片段。表明,成功获得了含有O型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。