嗜酸乳杆菌质粒的分析和穿梭载体的构建

为分析嗜酸乳杆菌内源性质粒pDX,并基于该质粒构建大肠杆菌-嗜酸乳杆菌穿梭载体。本研究从嗜酸乳杆菌XW118中分离获得内源性的质粒pDX,对其进行序列测定及功能分析,然后利用质粒pDX的复制子构建了能在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭的载体,并研究嗜酸乳杆菌的内源性质粒启动子在大肠杆菌中的活性和穿梭载体在乳酸菌中宿主的范围、转化效率和传代稳定性。结果显示嗜酸乳杆菌质粒pDX大小为2062 bp,GC含量为38.2%,包含4个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),推定为滚环复制质粒。质粒pDX在嗜酸乳杆菌中的拷贝数最高为31.05。本研究构建了基于质粒pDX复制子和启动子的大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体。该载体可转化多种类型的乳酸菌,转化效率在0.24×10^(2)~2.75×10^(3)CFU/μg(质粒量)之间,质粒丢失率在25.45%~48.36%之间。本研究通过构建获得能在大肠杆菌-乳酸菌穿梭的载体,并获得了在大肠杆菌中具有活性的乳酸菌内源性质粒的启动子,为乳酸菌基因工程和大肠杆菌代谢工程提供了新的操作途径。

枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

由枯草杆菌载体pUB110和大肠杆菌载体pGEM3构建了两个新的多功能穿梭载体pBE2和pBE3,它们具有强启动子和多酶切位点区。这两个载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,是比较理想的载体。

大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

ＩＪ６０２１和ｐＩＪ４１２３是链霉菌的高拷贝表达载体，它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子ＰｔｉｐＡ。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因（ｂｌａ），得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：ｐＨＺ１２７１和ｐＨＺ１２７２。将透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｉａｓｐ．）血红蛋白基因（ｖｈｂ）克隆到ｐＨＺ１２７２中，用它转化变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ），经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析和ＣＯ结合实验表明，在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白，从而证明所构建的ｐＨＺ１２７２载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用

利用基因重组技术,以枯草杆菌表达载体pWB980为骨架,插入大肠杆菌的克隆载体pUC18中的抗性基因和复制子,构建穿梭质粒pY980coli。将海洋细菌蛋白酶基因hspa插入pY980coli载体P43启动子下游,导入枯草杆菌WB600中,可实现活性表达。

GFP为报告基因的酵母哺乳动物细胞穿梭载体的构建及其在人血管内皮细胞中的表达

为研究酵母作为载体在口服基因治疗及免疫中的作用 ,需要一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞中表达的穿梭载体 .利用通用载体质粒融合系统 (UPS)构建了一种以GFP为报告基因的新载体 ,以常规的氯化锂法对酿酒酵母进行转化 ,证明该载体能够在酵母中复制 ;以脂质体介导向人血管内皮细胞进行了转染 ,有绿色荧光 ,证明该载体能够在哺乳动物细胞中表达 .

大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭载体的构建及PTEN在长双歧杆菌中的表达

长双歧杆菌可特异地定植于实体瘤低氧区,可用做肿瘤靶向性基因治疗的载体,而构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒则被证明是外源基因在长双歧杆菌中稳定表达的有效途径。为了构建能在长双歧杆菌中稳定表达外源基因的穿梭质粒并检测携带抑癌基因的工程菌对小鼠实体瘤的抑制效果,利用软件设计并合成了48条部分序列相互重叠的引物,通过PCR合成了长双歧杆菌质粒pMB1序列及长双歧杆菌HU启动子区序列,插入克隆载体pMD18-T,构建穿梭载体pMB-HU,该载体可在大肠杆菌DH5α及长双歧杆菌L17中稳定复制。PTEN基因编码具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌因子。将PTEN基因cDNA序列插入载体pMB-HU中HU启动子下游,构建重组质粒pMB-HU-PTEN,电击转化长双歧杆菌后,Western blot检测表明,表达产物中存在55kDa的PTEN蛋白特异条带。抑癌试验表明:与对照组相比,携带PTEN基因的长双歧杆菌可显著抑制小鼠实体瘤的生长。上述结果为以长双歧杆菌为载体的实体瘤靶向性基因治疗研究奠定了基础。

B.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1C基因的表达

以pUC19为母体，克隆了Btken－Ag（B.thuringiensissubsp.kenyaeAg）的复制起始区（～1．6kb）和pUC4K的aphⅠ基因，构建成穿梭载体pHV－1。pHV－1在E.coli中经100个世代，质粒保持率在80％以上；5在Bti4Q8（B．thuringiensissubsp.israelensis4Q8）中经40个世代，质粒保持率在80％以上。将B．licheniformis热稳定α－淀粉酶基因启动子控制下的Bt9510（B．thuringiensis9510）的crylC结构基因插入pHV－1，构建成重组质粒pHV－crylC，电激转化导入Bit4Q8。光学显微镜下观察，Bit4Q8无晶体产生；而Bit4Q8（pHV－crylC）则出现典型的菱形晶体，其晶体略小于Bt9510。生物测定结果表明表达的Cry1C蛋白对甜菜夜蛾具有一定的毒杀活性。

单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定

目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包括E1A、E1Bp及E1B55K基因片段;重叠PCR法扩增CR2区缺失的E1A基因;采用基因重组技术构建pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K重组质粒,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经测序证实获得的E1B55K及CR2区缺失的E1A基因与GenBank公布的完全一致,E1A基因CR2区缺失的pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K质粒经分别经XbaⅠ与KpnⅠ单酶切,得到大小约为817和1244bp的酶切片段,PCR鉴定得到约250及1148bp的基因片段,鉴定结果与预期结果完全一致。结论:E1A基因CR2区选择性缺失的单重靶向条件复制型腺穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K构建成功。

运用穿梭载体建立产甘油假丝酵母质粒基因文库

产甘油假丝酵母WL2002─5既具有耐高渗压性能，又能以葡萄糖为原材料高产甘油，且耐高渗压性能与高产甘油的能力相关。本研究以大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒YEp51为载体，通过对产甘油假丝酵母WL2002─5高分子量染色体DNA的提取、Sau3AI部分酶切、体外重组等建立起产甘油假丝酵母WL2002—5的质粒基因文库，库容为5．3×105，已满足对WL2002—5某一特定基因的克隆。

粪肠球菌内源性质粒的序列分析及其穿梭载体的构建

为了对粪肠球菌EXW27的内源性质粒pXW进行DNA序列的测定和分析,并基于其最小复制子构建大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体。本研究从具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27中分离得到了内源性质粒pXW,对其进行了DNA序列的测定及分析,然后利用质粒pXW的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体,并研究大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体的宿主范围、转化效率和稳定性。结果表明该质粒大小为8617 bp,GC含量为33.29%,包含8个ORF,推定为θ型复制质粒。质粒pXW在粪肠球菌EXW27中拷贝数最高可达32.09±0.93,表明质粒pXW属于高拷贝数质粒。本研究确定了质粒pXW的最小复制子,并基于该复制子构建了大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体pXWM1。该穿梭载体具有较宽的宿主范围,可成功转化至不同类型乳酸菌,转化效率介于1.96×10^(2)~8.96×10^(4) CFU/μg (质粒DNA)之间,质粒丢失率介于28.54%~54.17%之间。本研究成功构建了一个具有宽宿主范围、高转化效率以及高稳定性的大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体,为乳酸菌基因操作提供了新工具。

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞，通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ，除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外，还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９，成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座，获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ），在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．

实验性家兔骨关节炎的基因治疗Ⅰ:带有治疗基因的穿梭载体pLXSNhIL-1ra的构建及真核表达

本研究用含有人白细胞介素 - 1受体拮抗蛋白基因 (hIL - 1ra)的质粒pCD1-hIL - 1a和反转录病毒穿梭质粒pLXSN ,通过基因重组的方法 ,重组完成带有治疗基因hIL - 1ra的反转录病毒穿梭质粒pLXSNhIL - 1ra。通过DNA限制性内切酶的酶切鉴定 ,证明插入方向正确 ,通过把pLXSNhIL - 1ra穿梭质粒转染到Cos - 7细胞中进行真核表达 ,证明该质粒能够成功表达hIL - 1ra基因产物 ,为下一步用hIL - 1ra对骨关节炎动物模型进行基因治疗工作奠定了基础。

狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆及其腺病毒穿梭载体的构建

用狂犬病病毒CVS毒株经小鼠脑腔攻击后从发病鼠脑组织中提取总RNA,用带接头的特异性引物分别扩增出了狂犬病病毒核蛋白(N)基因和糖蛋白(G)基因。将N基因和G基因分别克隆入质粒载体pMD18T后,对筛选的含有N基因和G基因的重组质粒进行了全基因序列测定和分析。随后将狂犬病病毒N基因和G基因分别从其各自的克隆载体上双酶切消化,同时亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV。经卡那霉素抗性和酶切筛选,最终成功构建了含有N基因和G基因的重组穿梭载体pAdTrackCMVNG。

N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的:构建携带N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)基因的腺病毒5型(Ad5)穿梭载体,为NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的包装做准备。方法:以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3.1-NR2B获得目的基因NR2B;将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515,并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞,并以RT-PCR及W estern b lot分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。结果:经酶切和DNA测序证实目的基因NR2B被成功克隆入载体pDC515-NR2B中,RT-PCR及W estern b lot检测NR2B可在293细胞表达。结论:成功构建NR2B重组Ad5穿梭载体pDC515-NR2B,该载体可用于NR2B重组Ad5载体镇痛疫苗的包装。

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...

PDZ1/2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建

目的构建PSD-95结构域PDZ1/2腺病毒重组体。方法以异硫酸氰胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用RT-PCR法获得PDZ1/2的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4 DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①经RT-PCR得到了PDZ1/2的cDNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1/2和pAdTrack-CMV两条带;③PDZ1/2测序图谱与文献报道完全一致。结论成功构建了含目的基因PDZ1/2的腺病毒穿梭载体重组体。

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用

以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性菌质粒正负链复制区域的2·5kb片段,并与pE3载体上的大肠杆菌复制子和复制蛋白连接构建了3·2kb的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103。电转化pGJ103质粒至枯草杆菌DB104和1A747,均能稳定地复制。以pGJ103为骨架,克隆了不同大小的生物素基因片段,均能正确稳定地复制,证明载体有良好的承载能力。将2kb的热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga)克隆至pGJ103构建了载体启动子检测载体pGJ199。用pGJ199质粒载体作为启动子检测载体,对革兰氏阳性菌启动子片段P59进行了转录活性检测。并以该载体为启动子探测工具,通过鸟枪法得到了大量启动子片段。

PSD-95结构域PDZ1与腺病毒穿梭载体重组体的构建

目的构建突触后致密物质-95(PSD-95)结构域PDZ1腺病毒重组体。方法以异硫酸氢胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)法获得PDZ1的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①提取到未降解的总RNA;②经RT-PCR得到了PDZ1的cDNA;③酶切鉴定能观察到PDZ1和pAdTrack-CMV两条带;④PDZ1测序图谱与文献报道完全一致。结论获得了含目的基因PDZ1的腺病毒穿梭载体重组体。

贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立

目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan^R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan^R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果:构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论:建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。