利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究

为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。

乳酸菌载体pMG36e的应用现状

乳酸乳球菌通用表达质粒pMG36e是一个经典的人工构建的组成型表达载体,是以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成的。它包含一个强启动子,能够在多种细菌中表达外源蛋白。已用于研究细菌素作用机制,乳酸菌基因工程菌株的改造以及口服疫苗的开发等,应用领域十分广泛,已成为乳酸菌基因工程研究的重要工具质粒之一。现主要从载体构成、基因表达与食品级载体改造等三方面的应用对其进行综述,旨在为该质粒今后研究提供资料。

利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究

以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体,采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率。结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20mmol/LMgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2h,涂板筛选得到较高的电转化效率。特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μgDNA。本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组嗜酸乳杆菌pMG36e-E0-LA-5对犊牛的免疫保护作用

将构建的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因重组嗜酸乳杆菌pMG36e-E0-LA-5免疫犊牛,观察其对犊牛抗BVDV感染的免疫保护效果。选取1月龄犊牛,随机挑选20头分成4组,每组5只。1~3组为免疫组,分别口服接种1,5,10 mL重组嗜酸乳杆菌pMG36e-E0-LA-5(1010 CFU/mL),共免疫3次,每次连续免疫3 d,每次免疫间隔1周;第4组为空白对照组。分别于免疫后0,10,20,30 d检测血清IgG和粪便sIgA的水平和白细胞介素-12(IL-12)表达水平。三免后7 d用BVDV攻毒,5 mL/只(105.5/mL TCID50),观察免疫犊牛对BVDV感染的免疫保护效果。结果显示,pMG36e-E0-LA-5免疫犊牛体内血清IgG抗体和粪便sIgA抗体含量、血清IL-12表达水平显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),且对BVDV感染的保护率明显高于对照组。结果表明,pMG36e-E0-LA-5免疫犊牛,可诱生血清IgG和粪便sIgA类抗体,提高机体IL-12表达水平,有效抵抗BVDV的感染。本试验为研制用于预防BVDV感染的嗜酸乳杆菌活载体疫苗提供依据。

电转化方法将外源性质粒导入干酪乳杆菌的研究

以pMG36e,pMG36c和已消除内源性质粒的干酪乳杆菌(L.casei Zhang)为材料,在不同参数下进行电转化实验并建立最佳实验条件。结果表明:最佳电转化电压为1.5 kV,时间为2.0 ms。pMG36c转化不同对数生长期L.casei Zhang时,发现转化对数生长中期菌体获得的转化子数最高,而转化效率不是最高;转化生长初期获得的转化子数为4.04×106 mL-1,电转化效率为89.78%;后期则为1.6×107 mL-1和4.0%。磷酸钠作电击缓冲液获得的转化子数高于体积分数为10%甘油获得的转化子数。复苏培养基甘氨酸质量分数为0.5%时得到的转化子数最高,转化效率为35.56%;当甘氨酸质量分数增加到1%时得到的转化子数和转化效率分别下降到5.6×106 mL-1和6.22%,甘氨酸质量分数为2%时得到的转化子数和转化效率更低;不同质粒转化L.casei Zhang时,pMG36c转化获得的转化子数高于pMG36e转化子数。选择pMG36e转化L.casei Zhang的转化子为模板,通过PCR反应已证实转化试验的可靠性。本研究为外源基因电转化干酪乳酸菌提供了可靠的参考依据。

SQR基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建及其在大肠杆菌DH5a和乳酸菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e与目的片段SQR-Myc,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中,提取所得到阳性大肠杆菌菌株质粒pMG36e-SQR-Myc进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸菌MG1363中,采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测SQR蛋白质在其中的表达情况。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pMG36e-SQR-Myc被成功构建,目的蛋白质SQR在大肠杆菌和乳酸菌MG1363中被成功检测到。因此,乳酸菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。

乳酸乳球菌Nisin抗性基因nisI的克隆及作为筛选标记

【目的】以nisI作为食品级选择标记构建大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭载体。【方法】根据GenBank报道的乳链菌肽Nisin抗性基因nisI的序列,以pLEB590为模板,设计特异性引物,PCR扩增出nisI片段,经TA克隆、酶切鉴定及测序之后,亚克隆至大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭载体pMG36e中,重组子命名为pMG36e-NisI,再将pMG36e-NisI电转化至对Nisin敏感的乳酸乳球菌MG1363中。【结果】获得的重组菌MG1363/pMG36e-NisI在含有20IUNisin/mL的培养基中生长情况良好,遗传性能稳定,这表明nisI基因赋予了宿主菌MG1363对Nisin的抗性。【结论】nisI可以作为筛选标记用于食品级表达载体的构建。

表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突糖蛋白(S1)的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究从PEDV SDLY株中扩增得到S1基因序列,构建pMG36e-S1重组质粒并将其电转至乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中,制备表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组乳酸乳球菌。应用SDS-PAGE、Western-blot鉴定目的蛋白的表达。将重组菌口服免疫新西兰大白兔,中和试验检测小肠黏膜和血清中的中和抗体效价,间接ELISA方法测定血清中特异性IgG。结果显示,该重组菌能够有效引起动物体产生较高水平血清IgG和一定量的黏膜免疫中和抗体,表明该重组菌表达系统能刺激动物系统产生免疫应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。