穿膜肽修饰的PHBHHx负载紫杉醇递药系统构建

采用乳化溶剂挥发法、基因重组和蛋白纯化技术,制备了穿膜肽修饰的3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)负载紫杉醇(PTX)递药系统。通过调控乳化剂的种类、用量、包封材料与药物比例优化了纳米微球的尺寸、药物包封率及载药量,并对递药系统的尺寸、形貌进行了表征。结果表明:水包油型乳化剂选用0.5 mL的吐温-20、水相乳化剂选用60 mL(1%)聚乙烯醇,微球尺寸达到150 nm左右时,均匀性良好;PTX与PHBHHx比例为1∶50时,药物包封率及载药量达到最优,分别为81.02%和50.9 mg/g;递药系统分散度好,表面略显粗糙,基本呈球形,粒径约为150 nm。在最优条件下制备的PTX载药系统粒径较小,包封率较高,易实现功能化蛋白修饰,为PTX纳米药物提供了一种新的设计思路。

基于细胞穿膜肽传递系统提高内体逃逸效率的研究进展

细胞穿膜肽(CPPs)是一类能够穿透细胞膜的小分子多肽。它们能够将与之连接的生物活性分子(货物分子)通过直接穿透或内吞途径递送到细胞内。然而,通过内吞途径进入细胞的CPPs-货物分子复合物常常被困于内体中,导致CPPs所载运的货物分子的生物利用度低。本文总结几种已发现能提高CPPs及其载运货物分子内体逃逸效率的策略,期望为增强CPPs载运货物分子的生物利用度提供参考。

携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义

目的:构建携带具有穿膜功能的融合报告基因NT4-GFP-Ant基因的重组腺相关病毒载体。方法:应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因;用T4DNA连接酶将测序正确的GFP与已构建成功的Ant基因片段及PBV220/NT4线性质粒载体定向连接,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取融合基因,并将其连入腺相关病毒载体PSSHG中,构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关载体并进行酶切鉴定。结果:T-easy/GFP经EcoRⅠ酶切后,可得到730bp左右的片段,GFP基因经DNA测序证实与GenBank序列一致;pBV220/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到约为1000bp的基因片段;PSSHG/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到大小约为1000bp长度的基因片段。结论:成功克隆GFP基因,成功构建NT4信号肽-GFP-Ant穿膜肽融合基因和PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体。

肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。

一种新的人源性穿膜肽

目的观察一种新的人体蛋白结构域 (Circadianlocomoteroutputcycleskaputprotein′sDNA bindingpeptide,hCLOCK′sDNA_BIND)对细胞膜的穿透过程。 方法化学合成hCLOCK′sDNA_BIND ,N端标记FITC荧光素 ,与培养的血管内皮细胞 (ECV 30 4 )和原代培养的神经胶质细胞孵化后 ,荧光显微镜下观察并进行荧光强度分析。结果hCLOCK′sDNA_BIND能够有效通过细胞膜屏障 ,内化的量随孵化时间和肽段浓度的增加而增加 ,但温度的改变对其似乎没有影响。结论hCLOCK′sDNA_BIND具有很强的内化作用 ,为研究药物安全透过细胞膜屏障的载体提供了有效途径。

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造,构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a-T1-GFP,重组质粒在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白His-T1-GFP,经组氨酸亲和层析纯化后,用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His-T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a-T1-GFP,融合蛋白His-T1-GFP在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达率为20%。经组氨酸亲和纯化,得到纯度达85%的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP,动物实验表明融合蛋白His-T1-GFP能够有效跨过血脑屏障,主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了一种新的穿膜肽-T1,为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。

人乳头瘤病毒16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A2.1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P<0.05)。结论:在HPV16E7HLA-A2.1限制性CTL表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。

RGD与细胞穿膜肽共修饰脂质体靶向抑制肺癌A549细胞的研究

目的制备整合素受体精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg—Gly—Asp,RGD)和细胞穿膜肽(transcriptional actirator protein,TAT共修饰载紫杉醇(paclitaxel,PTX)脂质体(liposomes,LP)(RGD/TAT—LP—PTX),对其理化性质进行表征,并考察脂质体与肺癌A 549细胞的亲和力以及对A 549细胞增殖的抑制作用。方法采用薄膜分散法制备RGD/TAT—LP—PTX,考察脂质体的粒径,电位以及包封率,通过定量细胞摄取实验考察肺癌A 549细胞对RGDD/TAT—LP的摄取效率。构建A 549肿瘤球模型,定性共聚焦实验观察肿瘤细胞和肿瘤球对脂质体的摄取。噻唑蓝实验考察RSD/TAT-LP—PTX对肺癌A 549细胞的增殖抑制作用。结果 RGD/TAT—LP—PTX的粒径在(118.5±11.4)nm,电位为(21.58+2.42)mV,紫杉醇的包封率为86.5%。细胞摄取实验结果显示,PGD/TAT-LP在4 h摄取效率是2 h的1.88倍,差异具有统计学意义(P<0.05);肺癌A 549细胞在与脂质体共同孵育4 h后对RGD/TAT-LP的摄取效率分别是TAT—LP、RGD—LP和LP的2.1倍、2.8倍和5.1倍,差异具有统计学意义(P<0.01);MTT实验结果显示,在相同给药浓度下,不同脂质体组间细胞存活率有显著性差异(P<0.01)。结论整合素受体RGD和细胞穿膜肽TAT共修饰载紫杉醇(PTX)脂质体能够有效识别高表达整合索受体的肿瘤细胞,穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞,是一种潜在高效的肿瘤靶向给药系统。

穿膜肽HIV-Tat_(49-57)和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的 探讨穿膜肽HIV Tat4 9- 57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC Ⅰ类抗原提呈途径的可能性。方法 应用多肽固相合成技术 ,分别合成含HIVTat4 9- 57和HLA A2 1限制性CTL优势表位MART 12 7- 35的 18肽和该CTL表位 9肽。采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术 ,分别对上述 18肽和 9肽的穿膜能力进行了动态观察。进一步用标准51 Gr释放试验分别检测了上述 18肽和 9肽在HLA A2 1阳性健康者外周血单个核细胞 (PBMC)中诱导的表位MART 12 7- 35特异性CTL活性。结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质 ,并呈现出时间、剂量依赖关系 ;而 9肽则无此效应。与 9肽相比 ,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性 (P <0 0 5 )。结论 穿膜肽HIVTat4 9- 57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质 ,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答 。

穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究

目的以固相合成法合成穿膜肽TAT,并对合成产物进行活性评价。方法采用Nа-芴甲氧羰基(fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl,FMOC)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT。应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,pEGFP)质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响。结果高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%,相对分子质量1880。它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT。

新型穿膜肽作为基因运输载体的实验研究

目的人工设计合成穿膜肽新序列(CGRLWMRWYSPWARRYGC),并于体外考察其作为基因载体的潜力。方法采用Na-芴甲氧羰基(Fmoc)法固相合成穿膜肽新序列,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记N端。高效液相色谱及质谱仪检测其纯度及相对分子质量,流式细胞仪及共聚焦显微镜观察其穿膜能力,荧光显微镜和流式细胞仪观察其携带增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)进入细胞表达情况,MTT评价穿膜肽与质粒复合物的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测穿膜肽与质粒的亲和力及对质粒的保护作用。结果合成的穿膜肽纯度为96.13%,相对分子质量为2 348.42,流式细胞仪检测显示荧光阳性细胞平均约占98.81%,共聚焦显微镜可见荧光标记的穿膜肽分布于细胞内;穿膜肽携带质粒在人脐静脉内皮细胞中的表达率平均约为11.44%;不同电荷比的复合物对细胞的活性没有明显影响(P>0.05);琼脂糖凝胶电泳显示当穿膜肽与质粒的电荷比大于2∶1时,质粒不能迁移出来,电荷比为4∶1、8∶1和16∶1的复合物能够抵抗DNA酶Ⅰ的消化作用,以8∶1最为明显。结论人工设计合成的新型穿膜肽能够作为一种潜在的基因运输载体。

肝靶向穿膜肽与家蝇天蚕素基因的融合及其分子特征分析

本研究利用改进SOE-PCR技术构建肝靶向穿膜肽(HTPP)与家蝇天蚕素(MDC)融合基因并对其分子特征进行了预测和分析。结果表明:成功融合了HTPP与MDC,并构建了HTPP-MDC融合基因的克隆重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T。PCR和KpnⅠ/HindⅢ双酶切结果显示获得与预期大小一致的基因片段,测序结果显示获得的基因序列没有发生突变,与预期完全一致。分子特征分析表明,该融合基因编码60个氨基酸,分子量为6516.2Da,理论等电点为9.31,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成。研究结果为HTPP-MDC后续的功能研究奠定了基础,同时也为应用SOE-PCR技术构建融合基因提供了有益借鉴。

穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白。方法通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达蛋白后过层析柱纯化,蛋白电泳检测表达蛋白分子质量,蛋白飞行质谱分析检测蛋白序列,体外细胞实验验证其穿膜功能。结果电泳检测可见与CPPs-EGFP分子质量对应的电泳条带,构建质粒测序含有目的基因序列。蛋白电泳检测到纯度较高的融合蛋白,其蛋白序列与目的序列一致。体外细胞实验证实了融合蛋白的穿膜功能。结论成功制备了具有穿膜功能的CPPs-EGFP融合蛋白,为其促进抗体-蛋白微球偶联物进入肿瘤细胞发挥治疗作用的研究奠定了基础。

穿膜肽HIV Tat蛋白的研究进展

经数十年的研究发现HIV—ITat蛋白的转导域具有穿膜活性,能将外源性的生物学分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、质粒甚至颗粒性物质携带入多种哺乳动物活细胞质膜及核膜,并且对细胞不会产生毒副作用。尽管其穿膜途径的具体机制,目前尚不十分清楚,但却不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用。HIV-ITat蛋白转导域的发现及应用,为生物学研究领域开辟了一条新的探索途径。

穿膜肽修饰胸腺五肽类似物的合成和生物活性研究

采用Fmoc固相合成法,利用穿膜肽Tat对胸腺五肽(TP-5)进行修饰,合成了新的胸腺五肽类似物,总收率为32.2%.通过RP-HPLC和质谱对该化合物进行了鉴定,采用E-玫瑰花结实验进行生物活性分析,结果表明:经穿膜肽修饰的类似物在其摩尔浓度稀释20倍后仍然比标准品TP-5具有更强的生物活性.

穿膜肽的内化机制及其应用

穿膜肽是一类具有特殊穿膜功能的多肽分子,能携带其它分子甚至超分子颗粒穿膜进入细胞内部.早期研究认为,其进胞是一种无需受体、也不存在饱和状态的非经典胞吞行为.近年研究表明,其穿膜机制可能与其含有的氨基酸种类有很大关系.现在,穿膜肽的穿膜过程称为巨型胞饮行为,它与传统的胞吞形式很相似.当然,还可能存在着其它的进胞方式而没有被证明或发现.关于穿膜肽的应用也是人们最感兴趣的,在很多领域的研究都在进行并不断取得进展.不论是生物界还是医学界,穿膜肽都被认为将是一类非常有发展潜力的多肽分子.

细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究

细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽,该多肽一般由不多于30个氨基酸组成.针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽,设置不同浓度梯度,分别处理多种肿瘤细胞,荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱,并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数.结果表明:两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性.CPP33在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%,CPP44在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%.并且随着作用浓度的增加,两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升.因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.

穿膜肽为载体的分子影像学应用研究进展

由于细胞膜的天然屏障作用,使得许多生物活性分子难以进入细胞发挥作用,这使人们在分子水平上诊治疾病受到了很大的限制。穿膜肽是1988年新发现蛋白转导肽,它可以高效地穿透细胞膜,并且在不依赖受体、能量、温度情况下可携带多种活性物质进入各种细胞。本文就穿膜肽的特点,在功能上转运蛋白、抗体、脂质体、基因以及作为分子成像新途径能结合荧光素,磁共振对比剂等进行细胞内显影作一个综述介绍。

细胞穿膜肽的穿膜活性与序列特征的关系

细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是一种小分子多肽,能够容易地穿过细胞膜.这类分子,尤其是具有靶向功能的CPPs为高效率投送药物到靶细胞带来希望.因此,对其展开研究对于生物医学有着一定的意义.本工作主要从序列水平对具有不同穿膜活性的CPPs进行研究,试图找出影响CPPs穿膜活性的因素,以及不同活性CPPs与非穿膜肽(Non CPPs)序列上的差异,并引入一种分析生物序列的方法.我们基于CPPsite数据库和不同的文献获取CPPs和Non CPPs序列,并进一步从CPPs序列中提取具有高、中、低穿膜活性的穿膜肽(HCPPs、MCPPs、LCPPs)用于构建数据集.基于这些数据集,开展了以下研究:首先,利用方差分析的方法,对不同活性的CPPs以及Non CPPs的氨基酸及二级结构组成进行分析,发现氨基酸的静电与疏水相互作用对CPPs的穿膜活性起到了重要影响,同时螺旋结构和无规卷曲也会影响CPPs的穿膜活性;其次,使用理化性质与长度将不同活性的CPPs展示在二维平面上,发现在某些特殊的性质下不同活性的CPPs与Non CPPs可以产生聚簇现象,HCPPs、MCPPs以及LCPPs和Non CPPs被分成了三簇,这种现象显示了它们之间的差异;最后,本文引入了生物序列理化质心的概念,将组成序列的残基看作质点,进而把序列抽象成质点系进行研究,并将此方法应用到CPPs的分析中,通过PCA方法将不同活性的CPPs投射到三维平面上,结果发现绝大部分CPPs聚在一起,部分LCPPs与Non CPPs聚在一起.此工作对于CPPs的设计,以及理解不同活性CPPs序列上的差异具有一定的意义.另外,本文引入的生物序列理化质心的分析方法也可以用于其他生物问题的分析,同时它们可以作为某些生物分类问题的输入参数,在模式识别中起到一定的作用.

细胞穿膜肽TAT与小鼠干细胞转录因子Oct4融合表达及纯化

将TAT-Oct4目的基因插入pET28a表达载体,构建重组表达质粒pET28a-TAT-Oct4,形成大肠杆菌重组表达体系。融合蛋白TAT-Oct4在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达产物经纯化后,纯度可达90%以上。通过尿素梯度透析复性,TAT-Oct4平均复性收率为8.8%。细胞免疫荧光技术分析表明,TAT-Oct4融合蛋白可穿透近100%细胞的细胞膜,其进膜后主要分布于细胞核内。建立了具有活性的TAT-Oct4融合蛋白生物制备方法,为细胞重编程提供了一种有效的研究材料,并可为其他用于细胞重编程的干细胞转录因子设计提供实用的方法学。