重组人睫状神经营养因子突变体及其聚乙二醇修饰物的制备及其对ob/ob肥胖小鼠体重、糖脂代谢的影响

目的 制备重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)突变体[rhCNTF(R^6315)]及其聚乙二醇修饰物[P-rhCNTF(R^6315)],探讨两者对ob/ob肥胖小鼠体重及糖脂代谢的影响。方法 采用rhCNTF(R^6315)突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)表达rhCNTF(R^6315),经硫酸铵沉淀、Butyl HP和Q HP纯化后采用PEG修饰剂Y-40KD-MAL-mPEG对其C17游离巯基进行定点修饰,经QH P层析纯化获得P-rhCNTF(R^6315)。上述产物进行SDS-PAGE、纯度、修饰率、二级结构表征、修饰位点、体外活性、体内药代动力学检测。将ob/ob小鼠分为P-rhCNTF(R^6315)组(0.05、0.1、0.2 mg/kg)、rhCNTF(R^6315)组及赋形剂组,均采用高脂饲料喂养,同时设C57BL/6J组(普通饲料喂养C57BL/6J小鼠),检测各组小鼠的体重、摄食量及糖脂代谢情况。结果 rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)纯度分别为97.4%和99.3%,平均比活分别为9. 5×10^5和6. 9×10^5 IU/mg,相对比活分别为100%和72.6%;rhCNTF(R6315)修饰率达90%以上,大多数为单修饰产物,PEG修饰未影响rhCNTF(R^6315)的二级结构,修饰位点发生在DLCSR肽段的C17上;P-rh CNTF(R^6315)经皮下及静脉途径给药的血药浓度均在注射后约72 h降至给药前水平。与赋形剂组比较,P-rhCNTF(R^6315)0. 05、0.1、0.2 mg/kg剂量组小鼠在疗程结束时体重组分别减轻了10%、11%和21%(P <0.05),rh CNTF(R^6315)组减轻了30%(P<0.01);治疗后15 d,rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠摄食量明显降低(P<0.05),随后逐渐恢复正常水平;P-rhCNTF(R^6315)各剂量组从给药后8 d起,小鼠随机血糖有所降低,呈一定的量效关系,rhCNTF(R^6315)组从给药后4 d开始有所下降;P-rh CNTF(R^6315) 0.2 mg/kg剂量组和rhCNTF(R^6315)组的口服糖耐量(oral glucose resistant test,OGTT)曲线下面积(AUC0~2 h)及腹腔内脂肪重量显著降低(P<0.05),rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠皮下脂肪均显著降低(P<0.01)。结论 制备了较高纯度的rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315),两者对ob/ob肥胖小鼠的体重过高、高血糖症,体脂重量过高均具有良好的疗效,且P-rhCNTF(R^6315)更长效。