电喷雾质谱法研究细胞色素Tb5及其F35Y突变体蛋白肽链和脯基的相互作用

本文通过牛肝线粒体细胞色素Tb5和它的F35Y突变体蛋白相对分子质量的外标法测定，得到细胞色素Tb5全蛋白的相对分子质量为10077．5；脱辅基蛋白的相对分子质量为9 461．4．F35Y突变体全蛋白的相对分子质量为10093．6，它的脱辅基蛋白相对分子质量为9477．5。不同nozzle电压下的电喷雾质谱结果表明，该电压的大小明显影响蛋白肽链与血红素辅基之间的非共价结合。随着电压的降低，全蛋白质谱峰的强度逐渐增大。然而，过低的电压导致了Na^+，K^+离子加合峰相对强度的增加，而不利于谱图分析。同时，考虑到细胞色素Tb5在甲醇溶液和酸性溶液中的变性行为，因此选择nozzle电压为70V，10％的甲醇水溶液和pH＝7为得到全蛋白质谱峰的最佳条件。相同实验条件不得到的野生型Cyt和F35Y突变体全蛋白的质谱峰相比较，其相对丰度有悬殊的差异，表明F35Y突变体蛋白的血红素结合能力明显低于野生型蛋白。通过对解离出来的Heme b的分子离子峰进行解析，证明铁仍以三价离子存在于血红素辅基中。

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽白细胞介素-24突变体蛋白对肝癌细胞抑制作用

目的观察含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽模体的白细胞介素（IL）-24突变体蛋白（RGD—IL-24）对肝癌细胞的抑制作用。方法肝癌HepG2细胞分别加入各10μl的RGD-IL-24（8mg／L）、IL-24（8m（L）和磷酸盐缓冲液（PBS），噻唑蓝（MTr）比色法检测HepG2细胞生长抑制作用；DAPI染色检测HepG2细胞凋亡；免疫印迹法检测HepG2细胞bax、bel-2及Caspase-3蛋白表达；黏附实验检测与HepG2细胞的靶向黏附。结果RGD—IL-24、IL-24治疗4d后HepG2细胞存活率分别为（0．219±0．015）、（0．397±0．009），与对照组（0．823±0．013）比较差异有统计学意义（P〈0．01）。RGD—IL-24、IL-24治疗组细胞凋亡率分别为（0．631±0．027）、（0．472±0．031），与对照组（0．082±0．013）比较差异有统计学意义（P〈0．01）。RGD—IL-24抑制HepG2细胞生长、诱导凋亡效果均比IL-24显著增强（P〈0．05）。与IL-24治疗组比较，RGD—IL-24治疗组HepG2细胞促凋亡蛋白bax增加、抗凋亡蛋白bcl-2减少、活化Caspase-3蛋白量增加。黏附实验证实RGD-IL-24与HepG2细胞的靶向结合作用增强。结论含RGD肽模体的IL-24蛋白能通过与肝癌HepG2细胞的靶向结合增强其凋亡诱导作用。

重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N的表达、纯化及生物学活性的研究

目的表达、纯化重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N(rSEB-D9N),了解表达产物rSEB-D9N的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和肿瘤生长抑制作用。方法不同浓度IPTG诱导SEB-D9N突变体原核表达系统pET32a-SEB-D9N-E.coliBL21DE3表达rSEB-D9N,经Ni-NTA亲和层析法纯化rSEB-D9N,10%SDS-PAGE和高效液相色谱检测其纯度。以Vero细胞为靶细胞,进行rSEB-D9N的细胞毒性作用,并计算TCID50值。采用MTT法分别检测不同浓度的rSEB-D9N促人淋巴细胞增殖及抑制KB及MCF-7癌细胞株生长的作用。流式细胞术检测rSEB-D9N刺激人淋巴细胞后CD3、CD4、CD8的表达。结果rSEB-D9N表达产量约占细菌总蛋白30%,纯化后获得纯度为90.48%的rSEB-D9N。rSEB和rSEB-D9N对Vero细胞的TCID50值分别为3.12,8.85μg,10.0,20.0mg·L-1的rSEB-D9N具有显著的促PBMC增殖的作用(P<0.05),且主要上调CD3,CD4和CD8的表达。5.0～20.0mg·L-1rSEB-D9N作用的PBMC上清对KB和MCF-7细胞生长均可产生明显抑制作用(P<0.05)。结论获得并纯化了重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白(rSEB-D9N),其细胞毒性作用有所降低,但促人淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用仍较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤相关药物的候选突变体。

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽白细胞介素-24突变体蛋白的表达及其生物活性

目的获得含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽的白细胞介素（IL）-24突变体（RGD—IL-24）蛋白，研究其生物活性。方法用重叠聚合酶链反应（PCR）技术在IL-24cDNA序列中引入甘氨酸密码子GGC，构建RGD—IL-24eDNA，将其克隆入质粒pET28a（＋）获得pET28a／RGD—IL-24。pET28a／RGD—IL-24转化菌株BL21（DE3），采用亲合层析纯化蛋白，透析复性。SDS—PAGE电泳和Western blot鉴定RGD—IL-24蛋白。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测RGD-IL-24刺激外周血单核细胞（PBMC）产生IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α和干扰素（IFN）-γ的能力来测定RGD—IL-24免疫活性。细胞黏附实验检测RGD—IL-24与多种肿瘤细胞结合特性。结果成功获得RGD—IL-24基因，并构建表达质粒pET28a／RGD—IL-24。表达的RGD-IL-24蛋白约占菌体总蛋白的30％，纯化后蛋白纯度超过90％。RGD—IL-24处理的人PBMC培养上清IL-6、TNF-α和IFN-γ浓度（ng／L）分别为（780．5±98．3、2399．1±113．2、2130．1±98．6），显著高于IL-24处理组（551．0±52．1、1982．5±138．2、1762．9±119．8）。黏附实验证实RGD—IL-24能增强与肿瘤A549、HeLa和ACHN细胞靶向结合作用。结论含RGD肽的RGD—IL-24蛋白免疫生物活性及与肿瘤细胞靶向结合能力较IL-24明显增强。

重组葡萄球菌肠毒素A及其突变体蛋白促淋巴细胞增殖作用的研究

目的观察重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)及其突变体蛋白对淋巴细胞增殖、活化作用及对淋巴细胞亚群分群的影响。方法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)及小鼠脾淋巴细胞悬液,体外经rSEA及其3种突变体(rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A)蛋白刺激后,采用噻唑蓝法(MTT)检测人和小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用流式细胞术检测人外周血中T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+T细胞)及活化CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤细胞(NK)的含量。结果 5～20 mg.L-1的rSEA及其3个突变体蛋白对人PBMC和小鼠脾淋巴细胞均有明显促增殖作用(P<0.05);经rSEA、rSEA/H225A刺激后的人PBMC中,CD3+、CD4+、CD8+T细胞的含量明显高于对照组,rSEA/H187A能上调CD3+和CD8+T细胞,而rSEA/D227A只上调CD8+T细胞(P<0.05);rSEA及3种突变体蛋白均能上调活化CD4+和CD8+T细胞,rSEA、rSEA/H187A、rSEA/H225A能上调NK细胞含量(P<0.05)。结论 rSEA及其3种突变体(rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A)蛋白对淋巴细胞均有明显促增殖和活化作用,并可不同程度地上调T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞的含量,为筛选出低毒、高效的升白细胞相关药物候选突变体奠定基础。

水稻谷蛋白突变体的研究现状与展望

水稻 (OryzasativaL .)是基因组研究的模式植物。随着培育功能性专用品种日渐成为水稻育种的重要目标 ,作为研究真核生物基因表达调控理想材料的谷蛋白突变体也为功能性专用水稻品种的选育提供了优良的遗传资源。利用低谷蛋白突变体可以培育肾脏病和糖尿病患者专用的低谷蛋白水稻品种。笔者在概述水稻谷蛋白突变体的主要类型及其突变的遗传规律的基础上 ,结合其它作物中的成功范例着重介绍了低谷蛋白突变体的研究现状 ,探讨了后基因组学时代适用于功能性育种的水稻谷蛋白突变体的相关研究方向。

水稻谷蛋白突变体的分类及其分子生物学研究进展

水稻谷蛋白突变体不仅是研究真核生物贮藏蛋白生物合成和基因表达调控的重要遗传材料,也是培育功能性专用水稻品种不可或缺的优良种质资源。近年来,随着研究的不断深入,在谷蛋白突变体的遗传变异机理和育种等研究方面取得了明显进展。该文以国内外近年来有关文献为依据,综述了谷蛋白突变体的分类及其分子生物学的研究进展,并对谷蛋白突变体与功能稻育种的关系展开了讨论。最后,结合育种实践对今后利用谷蛋白突变体进行功能性水稻选育提出建议。

细胞周期突变体相关蛋白激酶2、P-糖蛋白和谷胱甘肽巯基转移酶-π在宫颈癌中的表达及临床意义

目的检测宫颈癌中细胞周期突变体(NIMA)相关蛋白激酶(Nek2)与耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、胱甘肽巯基转移酶-π(GST-π)的表达及其与临床病理特征的相关性。方法应用免疫组织化学法检测144例宫颈癌组织和32例慢性宫颈炎非癌组织中Nek2、P-gp、GST-π的表达。结果 1Nek2、P-gp和GST-π在宫颈癌及宫颈炎组织中的阳性表达率分别为(51.4%vs 31.2%)、(55.6%vs 12.5%)和(73.6%vs 53.1%),组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2Nek2表达与宫颈癌组织学分级、临床分期相关(P<0.05),与年龄、组织学类型、浸润深度、细胞角蛋白(CK)、CK14、癌胚抗原(CEA)、抗癌基因P16、生存时间无关(P>0.05)。P-gp、GST-π在宫颈癌的阳性表达与以上临床病理特征无相关性(P>0.05)。3宫颈癌中Nek2与P-gp、GST-π表达呈正相关(r=0.193和0.207,P<0.05)。结论 Nek2可能介导宫颈癌中P-gp、GST-π的表达。Nek2、P-gp及GST-π蛋白在宫颈癌发生、发展及耐药机制中发挥重要作用。联合检测对宫颈癌治疗方案的合理制定及化疗反应性的评估可能具有积极的临床指导意义。

血红素丙酸基甲酯化的细胞色素b_5及其F58位突变体蛋白的研究

为了进一步认识Phe58与血红素b之间芳环堆砌相互作用对蛋白质结构稳定性和性质影响的本质, 我们将Cyt b5和它的突变体F58Y, F58W蛋白的血红素丙酸根进行了甲酯化, 考察丙酸根参与的氢键网络是否对Phe58与血红素的p-p相互作用有影响. 各种谱学和反应的研究表明, 野生型及58位突变体蛋白甲酯化后, 58位芳环与周围芳环之间的堆积作用仍然存在, 但由于替代氨基酸残基的体积、疏水性及形成氢键能力等方面性质不同, 对蛋白的稳定性产生了一定的影响.

酶联免疫法研究天花粉蛋白突变体在猕猴体内的药动学

目的研究猕猴iv天花粉蛋白突变体（MTCS）的药动学。方法猕猴iv MTCS220μg／kg后，采用酶联免疫分析法（ELISA）测定动物血清中的药物质量浓度，血药浓度-时间数据用3P97药动程序拟合分析并计算药动学参数。结果MTCS在猕猴体内消除符合二房室模型。6只猕猴的平均消除半衰期（t1／2β）为（3.82±1.42）h，平均消除速率（CL）为（276．51±118．61）mL／（kg·h），药时曲线下面积（AUC（0-24h））为（1124.1±189.5）ng·h／mL。结论用ELISA方法能准确测定动物血清中MTCS质量浓度和研究其药动学。

重组天花粉蛋白突变体质量标准的研究和建立

目的：建立重组天花粉蛋白突变体（MTCS）的质量控制标准和检测方法。方法：用HL-60细胞株／MTT比色法定量测定MTCS体外生物学活性；用C4-HPLC和非还原型SDS—PAGE测定蛋白纯度；用毛细管电泳法测定等电点；用胰酶消化／RP—HPLC测定肽图；用还原型SDS—PAGE测定蛋白分子量等。结果：MTCS原液和成品对HL-60细胞的反应曲线与参考品的反应曲线一致，都呈现典型的S型曲线并且符合四参数方程式Y=（（A—D）／（1＋（X／C）^B））＋D，相关系数大于0．99；蛋白质纯度大于95．0％；等电点为9．16；蛋白原液的肽图与参考品肽图图形一致；分子量为2．72×10^4。结论：建立的MTCS质量控制标准和检测方法可以有效控制该制品的质量，并用于该制品的常规检定。

光谱与停流荧光法研究肌红蛋白及其突变体D60K与表面活性剂的相互作用

用停流荧光法、紫外光谱法、荧光光谱法和圆二色(CD)光谱法研究了肌红蛋白(Mb)及其突变体Mb(D60K)分别与两种表面活性剂的相互作用.停流荧光数据表明不同浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与Mb及Mb(D60K)相互作用均为(准)一级反应,虽然Mb(D60K)只是将肌红蛋白表面的60位天冬氨酸突变为赖氨酸,但二者性质差异显著,说明60位氨基酸对蛋白质性质影响较大.紫外、荧光与圆二色谱的结果也表明在上述表面活性剂作用下肌红蛋白及其突变体结构与功能均发生变化,其适应性和稳定性有一定差异.综合数据分析得知,肌红蛋白突变体D60K在表面活性剂溶液中性质更加稳定.

新的水稻谷蛋白α-1亚基缺失突变体(英文)

从水稻受精卵ＭＮＵ处理后代中获得４个谷蛋白α－１亚基缺失突变品系。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ分析表明这些突变体在共同缺失１条ｐＩ６．８２多肽的同时，或形成新的多肽，或其他多肽表现量增加，这些突变体是由结构基因控制的。ＩＥＦ分析同时显示２条多肽ＰＩ６．８２和ＰＩ８．５８源自同一条谷蛋白前驱体。这４个突变体对于改良水稻谷蛋白品质、研究谷蛋白生物合成遗传调控机制以及揭示谷蛋白基因功能是不可多得的研究材料。

用同源重组法将人肝金属硫蛋白突变体ββ基因整合在集胞藻6803中表达

将集胞藻 (Synechocystissp .)PCC 6 80 3上psbB的一段序列 (从 # 6 93bp到 # 2 5 6 3bp)插入pBluescriptKS的多克隆位点 ,构建带有整合平台的载体pKSB。再将人工合成的 ββ基因插入中间载体pRL_439上启动子PpsbA的下游 ,并将pRL_ββ上PpsbA和 ββ基因插入pKSB构建成整合表达载体pKSB_ββ。利用自然转化将整合表达载体导入集胞藻 6 80 3,并通过单交换同源重组使 ββ基因整合到集胞藻 6 80 3基因组DNA上。逐步提高氨苄青霉素浓度 ,筛选得到遗传性状稳定的转基因集胞藻 6 80 3。PCR检测转基因集胞藻 6 80 3,结果证实 ββ基因已整合到集胞藻 6 80 3的染色体上 ;Westernblotting结果表明 ,ββ基因在转基因集胞藻 6 80 3细胞中得到表达 ,ELISA测定表明在 5 0 μmol/L的Zn2 +诱导下 ββ在新鲜集胞藻 6 80 3中的蛋白表达量为 0 .739mg/g ;重金属耐受性实验表明 ,得到能耐受Cu2 +的转基因集胞藻 6 80 3。经原子吸收光谱法测定 ,转基因集胞藻 6 80 3在含低浓度Cu2 +(10 μmol/L)的培养液中对Cu2 +的去除率可达到 82 %

小鼠金属硫蛋白突变体αα-cDNA在烟草中的表达及转基因烟草对Cd^(2+)抗性的提高

金属硫蛋白是一类小分子量的金属结合蛋白 ,有 β,α两个结构域 .用另一个 α结构域取代金属硫蛋白的 β结构域 ,得到突变体 αα.通过 PCR法在 αα- c DNA翻译起始密码子 ATG前加入植物偏爱的碱基组合 AACA,构建 Ca MV双 35S启动子驱动的 αα- c DNA植物表达载体 p GPTVd35S-αα,此载体以抗除草剂基因 ( bar)作为选择标记物 .用根癌农杆菌介导的叶盘法对栽培种烟草 NC89进行转化 .Southern和 Western印迹分析表明突变体αα- c DNA已整合进入烟草基因组并且可以正常表达 .Northern印迹结果显示突变体αα- c DNA在烟草根部的表达强于叶部 .烟草根、茎、叶Cd2 +含量分析表明 ,转基因植物与对照相比 ,Cd2 +更多地集中在根部 ,在一定程度上降低了叶片中的 Cd2 + 含量 .Cd2 + 抗性实验进一步证明突变体αα- c DNA的表达提高了转基因烟草对 Cd2 + 的抗性 :转基因烟草在 2 0 0μmol/L Cd Cl2 条件下生长正常 ,在 40 0μmol/Cd Cl2 培养基内也可以存活 .而 1 0 0μmol/L Cd Cl2 即成为对照烟草的致死剂量 .

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白AI的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载脂蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JM109宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达

载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA_I_Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。

组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失突变体治疗兔视网膜静脉阻塞的疗效

目的在兔视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)模型上研究组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失突变体(reteplase,r-PA)的溶栓效果,并与重组人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA)对照,评价两种溶栓药物在静脉应用的疗效。方法光化学法诱导45只兔RVO模型(45只眼),分别静脉注射r-PA(15只眼)、rt-PA(15只眼)和注射用水(15只眼,对照组),4 h后观察血管再通情况,检测溶栓相关血液指标。结果给药后4h,r-PA组与rt-PA组静脉完全再通率分别为77.33%和为66.67%,无统计学意义;两者与对照组比较,完全再通率有统计学意义(P<0.001)。在给药后rt-PA组血浆凝血酶时间较r-PA组延长,血浆纤维蛋白原较r-PA组下降,且有统计学意义。结论静脉注射r-PA对兔RVO模型有治疗效果,疗效与rt-PA无明显区别,r-PA对凝血和纤溶系统的影响比rt-PA小。

抗赖氨酸加苏氨酸的玉米种子蛋白突变体

通过离体选择抗赖氨酸加苏氨酸玉米突变体，不仅获得了积累游离苏氨酸和赖氨酸等氨基酸的突变类型，也选择到了种子蛋白组份发生改变的高蛋氨酸突变体和高赖氨酸体细胞无性系变异体。高蛋氨酸种子中总蛋氨酸的含量比对照增高２２．６％，这是由于醇溶蛋白Ｚｅｉｎ－２部分及其蛋氨酸含量增高所致。高赖氨酸变异体种子游离必需氨基酸增高显著（２－１０倍），总赖氨酸比对照亲本增高２８．１％，含量约占种子干重的０．４０％，种子蛋白清蛋白、球蛋白和谷蛋白组份含量增高而醇溶蛋白减少。高赖氨酸和高蛋氨酸特性遗传稳定，植株育性正常。

金属硫蛋白突变体的烟草植物高效表达载体探讨

金属硫蛋白通常由α和β两个结构域组成,其中α的结构域构成包括Cd^(2+)和Hg^(2+),小鼠突变体则在大肠杆菌中进行搭建,并获得了转基因植株。为了更好地增强外源基因在烟草中的表达效果,可以在基因起始密码子ATG附近融入适合植物需要的碱基组合AACAATG,这种组合有利于将突变体基因插入具有35S强启动子的植物双元表达载体p GPTVd35S-BAR中,并获得αα突变体的植物双元表达载体。在该次研究中,将采用PCR-Southern和蛋白Dot-blotting检测方法,证明αα突变体可以在烟草中良好地表达。同时,在抗重金属的实验中证明转基因烟草能够在Cd400中良好的生长。