筛选在非生长条件下突变体酶的新方法

利用双层平板筛选由定向进化方法产生的瑞氏木霉内切葡聚糖酶III (EGIII)突变体文库 ,根据水解圈在平板上形成的速度判断酶活高低。采用这种方法在不同的筛选条件下分别筛选得到了几株在低温或碱性条件下高活性的EGIII突变体。比色法测定的酶活性与平板筛选结果一致。该方法的建立将使通过定向进化方法改造现有蛋白质 。

葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ,加入 2 μg mL硫链丝菌素诱导表达 12h。SDS PAGE电泳表明 ,两个穿梭载体在TK5 4菌株内表达出 42 5kD特异性条带。薄层扫描显示 ,突变体酶GIG138P和GIG138P G2 47D分别约占可溶性蛋白的19%和 2 2 %。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P G2 47D在变铅青链霉菌TK5

CYP2C9*58型新突变体的体外酶学活性研究

目的对CYP2C9基因新突变体(CYP2C9*58型)开展体外酶学功能研究,明确其代谢活性与野生型的相关性。方法以CYP2C9基因cDNA为模板,通过定点诱变方法获得CYP2C9各变异体的cDNA全长,用以构建昆虫表达载体。利用杆状病毒包装试剂盒包装昆虫病毒,侵染sf21昆虫细胞后获得高效表达CYP2C9各型蛋白的微粒体。以甲苯磺丁脲为探针底物药,利用获得的微粒体体外测定各变异体的最大反应速率V max和米氏常数K m,评价其主要酶促动力学特性。结果成功构建了CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型4种CYP2C9昆虫表达载体,Western blot证实该载体可用于稳定表达相应的CYP2C9突变体。CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型变异体的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的91.6%,13.5%和23.1%。结论 CYP2C9*58型的酶学活性较野生型明显降低,接近于典型缺陷型突变体CYP2C9*3型,提示携带此突变型的患者在服用经由CYP2C9代谢的相关药物时,药物代谢速度较野生型携带者会有一定程度的降低。

天冬氨酸酶体系中R-3-氨基丁酸相关物质HPLC方法研究

为了建立一种高效被大众认可的满足酶促体系中R-3氨基丁酸及相关物质的分析方法。基于显色法、衍生法本文探究了高效液相色谱UV检测器210 nm下采用特定流动相及检测参数的HPLC外标法。结果表明在选定的色谱条件下,R-3-氨基丁酸与相关物质可以和酶促反应中其它物质得到很好的分离,反应过程中底物巴豆酸在浓度0.05~0.4 g/L范围线性良好,R2大于3个9,产物R-3-氨基丁酸在此检测条件下灵敏度好,检测限、定量限符合规定,浓度0.35~2 g/L范围线性良好,R2大于3个9。该方法同时满足原辅料、催化反应、纯化结晶、成品含量及杂质检测。

枯草杆菌及大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

对枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶(BsIDH)、大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶(EcIDH)和大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的突变体酶(EmIDH)进行了纯化和酶学性质鉴定。BsIDH和EcIDH对辅酶NADP^+的特异性与NAD^+相比,分别是NAD^+的1 330倍和3 890倍。而EmIDH对NAD^+的特异性与NADP^+相比,是NADP^+的122倍。因此,BsIDH和EcIDH是NADP^+依赖性异柠檬酸脱氢酶,而EmIDH的辅酶特异性已转换为NAD^+依赖性。EcIDH、BsIDH和EmIDH对底物异柠檬酸的K_m值分别为67.4 μmol/L、60.6μmol/L和105.6μmol/L。BsIDH和EcIDH的最适反应pH分别为8.2和8.0,EmIDH的最适反应pH为7.0。BsIDH和EmIDH的最适反应温度是45℃,EcIDH的最适温度为43℃。三种IDH的活性依赖于不同的二价金属离子的存在,Mn^(2+)、Mg^(2+)存在时酶活性最强,Cu^(2+)、Ca^(2+)、Zn^(2+)和Ni^(2+)强烈抑制酶的活性。系统的酶学性质研究为深入认识IDH的催化与调节机制提供了更多依据。

利用核酸适配体封闭Tth DNA聚合酶突变体实现温启动一步法RT-qPCR

目的:Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶。为消除其在一步法逆转录-实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)反应时的非特异性扩增,筛选可在较低温度下抑制其活性的核酸适配体,从而实现温启动一步法RT-qPCR。方法:在前期获得不依赖Mn2+的Tth DNA聚合酶突变体的基础上,检验四种DNA适配体及其对应的RNA适配体对Tth DNA聚合酶突变体的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性的封闭效果以及解离温度,并通过分子对接模拟适配体与聚合酶的结合模式。结果:TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在40℃可有效抑制Tth DNA聚合酶的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性,抑制率达到97%以上;两种适配体在50℃可几乎完全解离。这两种适配体均可用于温启动一步法RT-qPCR,其中TQ21-11-RNA的非特异性扩增更低。结论:利用TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在室温下封闭Tth DNA聚合酶突变体活性,可以实现温启动一步法RT-qPCR。

3-(吲哚-3-基)-4-(吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基)马来酰亚胺脱氢类异柠檬酸酶-1突变体高效抑制剂的合成与评价

合成了一系列新型的3-(吲哚-3-基)-4-(吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基)马来酰亚胺,并评价了其对异柠檬酸脱氢酶1突变体(R132H)的抑制活性.大多数化合物对IDH1-R132H表现出较强的活性.其中化合物3-(1-(3-(1-(1H-咪唑-1-基)丙基)-6-溴-1H-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(9b)是最有前途的IDH1-R132H抑制剂,IC50值为31 nmol/L,并能显著抑制异柠檬酸脱氢酶1突变(R132H)型人脑星形胶质母细胞瘤细胞中2-HG的产生.根据实验数据进行了初步的构效关系讨论和分子模拟研究.

多酶融合表达体系以木聚糖为辅助底物高效合成(S)-苯乙二醇

【目的】利用木聚糖为辅助底物加强手性催化反应中的辅酶循环,构建来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.) YX-1葡萄糖脱氢酶突变体Ala258Phe/GDH和里氏木霉(Trichoderma reesei)RutC-30木聚糖酶(XYN2)在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的融合表达体系,高效合成(S)-苯乙二醇。【方法】调节3种酶编码基因在pET-28a载体上的位置,运用重叠延伸PCR技术,构建了E.coli/pET-SCRⅡ-A258F-XYN2和E. coli/pET-A258F-SCRⅡ-XYN2两种重组菌,研究了其合成(S)-苯乙二醇的最适反应条件。【结果】重组菌株E.coli/pET-SCRⅡ-A258F-XYN2在底物2-羟基苯乙酮与辅助底物木聚糖的比例为1:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达98.8%(W/W);而重组菌株E. coli/pET-A258F-SCRⅡ-XYN2在底物与辅助底物的比例为2:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达95.6%(W/W),两者合成产物的光学纯度均>99%。【结论】通过构建3种酶的融合表达体系,成功将木聚糖酶和葡萄糖脱氢酶突变体介导的辅酶再生循环体系引入不对称生物合成反应,提高了手性转化效率,为将大自然中丰富的木聚糖用于手性催化奠定了较扎实的研究基础。