靶向非病毒载体一次及持续介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因转导卵巢癌细胞的比较

目的比较靶向非病毒载体GE7系统介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV1-tk)基因一次及持续转导卵巢癌细胞的转导效率及杀伤效应。方法靶向非病毒载体系统GE7分别与标志基因β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和治疗基因HSV1-tk基因构成载体复合物,一次及持续体外转导卵巢癌细胞CaOV3,通过5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖甙(X-gaI)染色比较GE7系统一次及持续转导外源基因的转导效率。将丙氧鸟苷(GCV)加入一次及持续转导HSV1-tk基因的卵巢癌细胞,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞分析等,观察GCV对一次及持续转导GE7/HSV1-tk的卵巢癌细胞的杀伤作用。结果X-gal染色显示,GE7-次转导外源基因的平均转导效率可达80%,持续转导达85%。当GCV为1μg/mL时,GE7/HSV1-tk一次转导的生长抑制率达82%,凋亡指数为15,而持续转导可达90%,凋亡指数为30。在相同的GCV浓度下,持续转导GE7/pCMV-tk卵巢癌细胞生长抑制率显著高于一次转导(P<0.05)。结论GE7载体系统持续转导卵巢癌细胞较一次转导的平均转导效率高,持续转导的GE7/HSV1-tk/GCV基因治疗系统杀伤作用更大。

猫疱疹病毒Ⅰ型环介导等温扩增检测方法的建立

建立一种环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现对猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的快速、准确、简便检测。根据Gen Bank中FHV-1的TK基因设计引物,优化反应条件,通过琼脂糖凝胶电泳和SYBR GreenⅠ染色观察分析扩增效果。该方法特异性好,敏感性检测实验表明该检测方法最低能够检测到的模版是101copies/μL,是PCR检测方法灵敏度的10倍。金属浴、烘箱、恒温水浴锅与PCR仪四种不同的扩增反应仪器均可达到LAMP的要求,扩增出梯形条带。建立了针对FHV-1的LAMP检测方法,该种检测方法具有高特异性的扩增引物,对检测的仪器、反应条件及检测人员技术要求比较宽松,从扩增开始到通过SYBR GreenⅠ实现的结果可视化解读所用时间不到1 h,实现了快速、准确、简便检测FHV-1的目的。

非病毒载体介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因治疗卵巢癌的体外研究

目的 探讨靶向非病毒载体GE7在卵巢癌细胞株CAOV3细胞中的转导效率 ,及其介导的Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 (HSV1 tk) /更昔洛韦 (GCV)基因治疗系统在卵巢癌治疗中的应用。方法 构建由表皮生长因子受体 (EGFR)介导的非病毒载体GE7,分别与外源基因 [即报告基因 β 半乳糖苷酶 (β gal)和治疗基因HSV1 tk]构成载体复合物 ,体外转导CAOV3细胞 ,通过 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖苷 (X gal)染色、核酸分子印记杂交分析 ,观察非病毒载体GE7对外源基因 β gal及HSV1 tk基因的转导情况 ;将GCV加入转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞 ,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞仪分析等 ,观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 β gal基因的转导效率可达 80 % ,呈瞬时表达 ;加入 10mg/L的GCV时 ,转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞的生长抑制率可达 95 % ;流式细胞仪分析显示 ,CAOV3细胞S期比例上升 ,最高达 90 % ,凋亡指数高达 30。结论 GE7载体系统能高效地将外源基因导入CAOV3细胞 ,GE7/HSV1 tk /GCV基因治疗系统在卵巢癌治疗中可能具有良好的应用前景。

动脉灌注GE7系统介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因导入大鼠卵巢癌细胞

目的 采用大鼠诱发性卵巢癌模型,观察经肿瘤动脉灌注结合GE7导入系统对Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（HSV1-tk）转导的效率和靶向性.方法 构建GE7四元复合物,将诱发的荷瘤大鼠9只随机分成A组、B组和C组,A组经卵巢动脉注入四元复合物（8μg/只）,B组注入同体积生理盐水,C组经尾静脉注入四元复合物（8μg/只）.给药72 h后,分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测大鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺及肾脏组织的HSV1-tk mRNA及蛋白的表达.结果 A组肿瘤组织中HSV1-tk mRNA和蛋白均高表达,而其他组织中则无表达或表达极少 B组未见HSV1-tk mRNA及蛋白的表达 C组肿瘤组织中未见HSV1-tkmRNA和蛋白的表达,肝脏、脾脏、肺脏及肾脏组织中则有少量的表达.RT-PCR半定量检测结果显示,A组卵巢肿瘤组织中的HSV1-tk mRNA含量（1.692±0.221）明显高于C组卵巢肿瘤组织（0.012±0.002 P〈0.01）.结论 动脉灌注结合GE7导入系统对HSV1-tk有较高的转导率和靶向性,为HSV1-tk/GCV治疗系统在卵巢癌基因治疗的应用提供了新的策略.

动脉灌注GE7系统介导1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／羟甲基无环鸟苷对大鼠诱发性卵巢恶性肿瘤的作用

目的观察非病毒载体介导1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSVl-tk）／羟甲基无环鸟苷（GCV）基因治疗系统，经肿瘤供血动脉灌注，对大鼠诱发性卵巢癌的作用，并初步探讨其作用机制。方法构建GE7-polylysine／pCMV-HSVl-tk／polylysine-HA20四元复合物，取二甲基苯蒽（DMBA）诱发的大鼠卵巢肿瘤模型18只，随机分为3组，每组6只。分别经卵巢供血动脉注入四元复合物8“g／只（Atk组）、同体积的生理盐水（ANS组），经尾静脉注入四元复合物8μg／只（Vtk组）。72h后，3组大鼠均腹腔注射GCV，50mg·kg-1.d-1，连用10d。停药后3d处死大鼠，瘤体称重，计算抑瘤率。采用流式细胞仪检测各组大鼠卵巢肿瘤细胞的细胞周期变化和细胞凋亡情况。结果Atk组大鼠肿瘤瘤重为（4．774-2．31）g，明显低于ANS组[（14．66±6．26）g，P〈0．01]和Vtk组[（17．53±7．19）g，P〈0．01]。Atk组抑瘤率为67．5％Vtk组的抑瘤率为-19．6％。流式细胞检测结果显示，Atk组S期细胞占（54．32±9．65）％，高于ANS组[（27．434-9．22）％，P〈0．01]和Vtk组[（30．16±11．57）％，P〈0．01]。Ark组肿瘤细胞凋亡率为（39．15±12．16）％，高于ANS组[（11．864-5．28）％，P〈0．01]和Vtk组[（14．32±6．43）％，P〈0．01]。结论HSVl-tk在GE7导人系统介导下，经卵巢供血动脉导人大鼠卵巢肿瘤组织，给予GCV后，可使肿瘤细胞阻滞于S期，促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥良好的抑瘤作用。

羟甲基无环鸟苷对携有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

据《中华妇产科杂志》1997年12月32卷第12期报道 上海医科大学妇产科医院徐丛剑等,为观察羟甲基无环鸟苷（GCV）对携有Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（HSV1-tk）的人卵巢上皮癌AO细胞的体内杀伤效应。

一种嵌合型调控元件在肿瘤靶向基因治疗中的应用

肿瘤靶向基因治疗成功的关键是调控治疗基因在肿瘤细胞中特异、高效地表达。首次构建一种嵌合型表达调控元件,旨在转录水平、转录后水平和翻译水平上实现联合调控目的基因在肿瘤细胞中特异性表达。体外实验表明,在前列腺癌细胞系LNCa P中,该调控元件可将报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和荧光素酶(luciferase)的肿瘤表达特异性分别提高420%和480%。体外细胞存活实验表明,运用该元件调控单纯疱疹病毒-1胸腺激酶(HSV-1 TK)的表达能特异性杀伤LNCa P细胞,验证了该元件可成功用于治疗基因的肿瘤靶向表达。

报告基因系统HSV1-sr39tk/FIAU监测治疗基因表达的体外研究

构建HSV1-sr39tk为报告基因,以VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体Ad5-sr39tk-IRES-VEGF165(Ad5-SIV),将其以不同感染复数(MOI=0、10、25、50、75、100)感染大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫激光共聚焦技术检测HSV1-sr39tk与VEGF165的表达。用酶联免疫吸附试验(ELISA)监测感染病毒后细胞培养上清中VEGF165蛋白分泌量;细胞摄取131I-FIAU实验监测HSV1-sr39tk报告基因的表达情况,以腺病毒包装增强型绿色荧光蛋白(Ad5-EGFP)为对照。结果显示:免疫共聚焦显微镜可观察到HSV1-sr39tk蛋白与VEGF165蛋白在细胞内成功表达;VEGF165蛋白分泌情况与MOI间呈线性正相关(P<0.05);感染Ad5-SIV后细胞对131I-FIAU摄取率增高与MOI间呈线性正相关(P<0.05)。不同时间摄取实验结果显示:30-150min间细胞摄取率迅速增高,之后增高减慢,进入平台期。MOI相关摄取结果与MOI相关ELLISA结果具有较好相关性(P<0.05)。Ad5-SIV经感染后可在大鼠骨髓间充质细胞中成功表达,并且治疗基因VEGF与报告基因HSV1-sr39tk的表达呈正相关,说明可通过报告基因HSV1-sr39tk监测治疗基因VEGF165的表达,为动物水平报告基因显像提供理论支持。