人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将其克隆进表达载体pET-22b(+)中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b(+)/K5 mut1 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2+-His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定?【结果】 PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mut1基因片段,正确插入pET-22 b(+)载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量Mr≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L?【结论】 成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白?