一种简便高效的寡核苷酸指导的基因定位突变技术

随着基因工程和蛋白工程的发展,寡核苷酸指导的基因定位突变技术的应用越来越广泛。但在实际应用的过程中,筛选出所设计的突变克隆仍是比较耗时的。虽然,突变的理论值达50％,而在实际工作中则远远低于此值。造成这种现象的原因很多,包括突变引物的设计是否合理,退火及合成是否完全,模板制备是否符合标准以及M13系统正链转染特性等。过去,人们为提高突变率曾对此方法进行过多次改进。例如,为了富集含突变引物的双链,有用S1外切酶消化法、碱性蔗糖超速离心法、氯化铯密度梯度离心法、溴化乙碇存在下的凝胶电泳,以及用羟基磷灰石吸附单链,等等。但是,这些方法都比较复杂,流程又长。近来,PCR技术已经用于基因定位突变,并可将突变率提高至99％以上,但突变位点和突变方式的随意性仍有一定局限。

应用定点突变技术进行流感病毒NS1蛋白功能的研究

目的流感病毒NS1基因敲除毒株(delNS1毒株)的获得可以使我们建立更有效的生物学关系,主要表现在流感病毒繁殖周期和致病的过程中,流感病毒NS1蛋白和双链RNA活性蛋白激酶(PKR)之间的生物学关系.资料表明,缺少功能性的PKR可以使delNS1毒株在其他非允许宿主中繁殖,这表明流感病毒NS1蛋白的主要功能是对抗或阻止PKR调解抗病毒效应.因此,本实验为了证明流感病毒NS1蛋白对其复制和毒力的影响.方法应用定点突变技术进行流感病毒NS1基因的第38位和第41位氨基酸残基位点的定点突变;然后进行细胞转染包装成新的缺陷病毒;再对其进行转染后产量的测定,如TCID50和PFU.结果包装成的缺陷病毒与包装成的非缺陷病毒相比,缺陷病毒的TCID50和PFU明显下降.结论本实验证明了流感病毒NS1蛋白在流感病毒复制过程中,使其产量和毒力下降.

定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点

目的利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6(MIC6)与醛缩酶的作用位点。方法根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(V)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物。以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物。分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物。结果获得了MIC6C W/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白。GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带。结论色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点。

紫露草雄蕊毛突变技术对饮用水诱变剂的检测试验

[目的]验证紫露草雄蕊毛突变技术检测饮用水诱变剂的可行性。[方法]采用紫露草雄蕊毛突变检测法、紫露草花粉母细胞四分体微核检测法,对采自桂林市雁山区和七星区的自来水、井水、泉水、山洞水的8份水样的诱变剂污染情况进行检测,同时作MH对紫露草雄蕊毛突变检测法进行验证试验。[结果]不同水样诱发的突变率呈现不同程度的效应,只有2份水样检测出诱变剂污染。同一水样2种检测方法诱发的突变率呈现相同程度的效应,受到诱变剂污染的2份水样属同一污染程度。验证试验表明3种MH浓度下的检测结果均有显著性差异,与国际协作研究的验证结果一致。[结论]紫露草雄蕊毛突变检测法是检测环境中诱变剂存在的有效方法,可用于即位评价环境污染。

定向诱导基因组局部突变技术研究及应用进展

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术是反向遗传学中研究功能基因的一种全新的方法。TILLING技术借助高通量检测手段,快速有效地从突变群体中鉴定出点突变。系统介绍了TILLING技术的基本原理和技术路线,同时总结了TILLING技术本身有待解决的一些问题。

突变技术及其应用简介

突变是指遗传基因的永久性可遗传改变。通过突变技术可以有目的地取代、插入或删除已知DNA序列中的特定核苷酸。人们逐渐对突变技术有了一定的了解,已越来越多将该技术应用在医药、农业、酶工业等领域中,来人为地改变某些不理想的基因。

小麦诱发突变技术育种进展探究

突变育种技术是运用中子、射线和离子等物理辐射因素亦或是空间环境诱变种子或是植物离体组织,最终获取有益突变体,极大的缩减育种周期,诱变育成品种数据库统计研究表明,到二零一六年五月份,全世界在200余种植物品种的基础上,已经有超过三千个突变品种,小麦突变体共有200余种,我国诱变小麦有164种,基于此,笔者针对小麦诱发突变技术育种研究进展进行了相应的分析,以下为详述。

基因定点突变技术简介

一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。本文简要介绍具有代表性的三种基因定点突变技术。

基于CRISPR/Cas9点突变技术构建HIV-1基因型耐药检测质控品

目的人外周血淋巴细胞株8E5可分泌无感染性HIV-1病毒颗粒,靶向于8E5细胞株基因组整合的HIV-1前病毒基因POL区,基于CRISPR/Cas9点突变技术构建含有POL区耐药突变位点的单克隆细胞株,可用于制备一种安全稳定的新型HIV-1基因型耐药检测质控品。方法设计构建小向导RNA(single guide RNA,sgRNA)和Cas9共表达载体以及携带有目标突变位点的供体单链寡核苷酸(donor single-stranded oligonucleotides,Donor ssODN)共转染8E5细胞,通过流式微孔板分选获得转染成功的阳性单克隆细胞株,通过Sanger测序确认定点突变的编辑效果。对定点突变编辑成功的单克隆细胞株培养至第3代、5代和7代的细胞及细胞分泌到上清中的HIV病毒颗粒进行Sanger测序,验证定点突变的编辑效果。结果成功构建双sgRNA和Cas9共表达载体,与携带有耐药突变位点Q151M的Donor ssODN共转染8E5细胞株的效果良好。对分选获得的共转染阳性单克隆细胞株进行靶位点测序,结果显示成功构建了携带有定点突变Q151M的纯合子单克隆细胞株8E5Q151M。细胞株8E5Q151M多次传代后的细胞及细胞分泌的无感染性HIV-1病毒颗粒可被持续检测出Q151M突变位点。结论利用CRISPR/Cas9点突变技术成功构建稳定携带有Q151M耐药突变位点的细胞株8E5Q151M,为制备HIV-1基因型耐药检测质控品提供新的技术平台。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

体外突变技术在研究蛋白激酶CK2中的应用

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普通存在的非信使依赖性丝 /苏氨酸蛋白激酶 ,在细胞增殖和分化、信号的传导和加工、细胞凋亡等方面起重要作用。体外突变技术是在DNA重组及测序等技术的基础上发展起来的一项技术 。

技术突变下企业自主创新战略定位方法研究

从企业环境优势和创新能力维度,构建了技术突变下企业自主创新战略定位的分析矩阵;应用模糊综合评价法,对建立的企业自主创新的环境优势和创新能力指标体系进行了定量综合评价;从而构建了一套技术突变下企业自主创新战略定位的有效方法,进而运用该方法对我国17家比较有代表性的有生物制药业务的企业进行实例评价和战略定位。

技术突变下后发大国自主技术创新战略研究

阐述了技术突变下后发大国实施自主技术创新战略是实现跨越式发展的必然选择的观点,进而分析了后发大国实施自主技术创新战略的优势和劣势,并提出了后发大国自主技术创新战略的宗旨、目标、重点和对策。

技术突变下后发国家的企业自主创新环境及其优化

技术突变对后发国家的企业来说,是挑战,更是实现跨越式发展的大好机遇。分析了目前企业自主创新在技术产业化、国际产业转移、国家创新体系支持和知识产权保护等方面具有的特点,阐述了在技术突变下企业自主创新在资源保障、应对转换成本、消除文化障碍等方面应有的保证条件。在此基础上,分别从政府和企业主体两个层面,提出后进国优化企业自主创新环境、实现跨越式发展的对策。

突变性技术创新驱动下政策组合链条研究

突变性技术的出现为中国企业实现弯道超越提供了机会。辨识我国当前在推动突变性技术发展政策方面存在的"碎片化"、"粘性化"和"分离化"现象,系统研究突变性技术阶段性演进规律,在此基础上,分析政策组合及其生命周期管理,重点研究政策窗口开启与关闭的触发机制。研究结果表明,在突变性技术不同演进阶段,不同政策的作用敏感性存在很大差异,构建一条与突变性技术发展轨迹高度契合,且能够覆盖突变性技术不同发展阶段的政策组合链条具有重要现实意义。

能源回弹效应下高碳产业低碳转型过程中的技术突变性

考虑能源回弹效应下,分析高碳产业低碳技术突变技术门槛,发现技术碳减排存在由量变到质变的门槛效应,另外还发现能源回弹对门槛效应具有显著影响。运用Hansen门限面板模型、结合CD生产函数的能源回弹模型发现:①不考虑能源回弹效应,高碳产业低碳化过程中的技术突变存在两个门槛;②考虑能源回弹作用,将减少为一个门槛,并且将延长高碳产业完成低碳技术突变所需时间。因此,为加快高碳产业低碳技术突变,有效减少碳排放,一方面应缓解能源回弹效应的影响,对能源回弹效应较大的高碳产业采取实时监控,对能源回弹较小的高碳产业采取定期检查和不定期抽检方式监控;货币政策、财政政策和产业政策相互配合,在高碳产业拉动经济增长的同时,最大限度控制能源回弹效应。另一方面,市场手段和政府职能双管齐下,协助企业低碳技术升级和设备改造,优化税收结构,弥补低碳技术升级导致的负外部性,完善高碳产业转移或市场退出机制。

技术突变与产业调整

揭示了技术突变引发产业调整的规律,阐述了在技术突变条件下发展中国家完全依赖技术引进的技术进步方式将面临巨大的风险,进而提出发展中国家应对技术突变的产业发展对策。

基因点突变检测技术研究进展

基因点突变与疾病的关系日益受到重视 ,但传统的点突变检测方法因其敏感性低、特异性差和操作复杂而使点突变的研究受到限制。为此 ,人们进行了许多新技术的开发和利用 ,尤其是 PCT-探针技术、荧光能量传递技术 (FRET)、新设备和软件技术的有机结合 ,使点突变的检测更精、更准、更快。本文就近年开发的具有代表性的点突变检测技术的原理。

体细胞HPRT基因位点突变检测技术及其在电离辐射研究中的应用

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HPRT)基因在单基因突变的研究中是一个经典的基因位点。本文概述了 HPRT基因位点突变检测的原理 ,列出了几种检测方法 ,并讨论了影响 HPRT基因突变频率测定的几个因素以及 HPRT基因突变在生物剂量估算中的应用 ,最后与其它辐射生物剂量计进行了比较。