分枝杆菌利福平耐药基因rpoB高通量突变文库的构建

【目的】建立利福平耐药基因rpoB高通量突变文库。【方法】通过同源重组和L5 attB噬菌体整合位点交换构建耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株;基于L5 attB质粒交换系统和抗性选择培养基,挑取48个克隆以验证质粒替换的效率;针对利福平耐药决定区(RRDR)区域内以每3个碱基为单位设计简并性引物,通过PCR扩增获得该区域81个碱基的全覆盖式突变文库;文库片段与载体进行无缝克隆转化到大肠杆菌中形成大肠杆菌突变文库;基于质粒交换原理,将突变质粒库转化至耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株中,替换原有L5 attB位点质粒,形成耻垢分枝杆菌突变文库;通过基因组提取、建库和高通量测序明确文库的基因型种类。【结果】与野生型rpoB基因(5600 bp)相比,敲除株的扩增片段为2200 bp,证明耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB条件性敲除株构建成功;质粒替换的成功率为100%;大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库中单氨基酸突变类型均为540种,大肠杆菌文库多点突变5301种,耻垢分枝杆菌文库多点突变853种,大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库相关系数为0.84。【结论】开发了一种针对分枝杆菌必需基因rpoB突变体文库的构建策略,成功建立了利福平耐药基因rpoB的突变文库。

人干扰素α1c/86DAB环突变文库的构建及细胞筛选

人干扰素α１ｃ／８６ＤＡＢ环突变文库的构建及细胞筛选马学军胡荣１吕海２魏开坤张丽兰薛水星侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所，病毒基因工程国家重点实验室北京１０００５２）噬菌体表面呈现（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术是由Ｓｍｉｔｈ〔１〕博士于１９...

通过原位易错PCR一步构建基因突变文库

主要介绍一种通过原位易错PCR构建随机突变文库的新技术。本实验室最近发表的一项国际专利中,利用来源于海栖热孢菌的极耐热性DNA连接酶,在传统PCR循环中加入一个连接步骤,即变性—退火—延伸—连接的四步循环法PCR,从而实现环状质粒的PCR指数扩增(PPCP)。原位易错PCR中所用引物为一段线性双链DNA,它含有与模板质粒不同的筛选标记,产物转化宿主菌后,模板质粒在筛选平板上被直接剔除。筛选到的阳性突变子可用作模板直接进入突变文库的再次构建,通过筛选获得二级或多级累加的正突变。利用这种方法构建了一个木聚糖酶基因和一个纤维素酶基因的随机突变文库,并筛选出具有正向突变的蛋白,证明以PPCP为基础的原位易错PCR技术,为基因定向进化提供了一种快速有效的随机突变文库构建的新方法。

PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库

针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型（PDM）,在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95%。

金葡菌转座子测序文库的构建及促蛋白酶的活性基因鉴定

背景金黄色葡萄球菌能产生多种蛋白酶引起侵袭性感染,转座子测序技术是发掘基因功能的有力工具,从基因组层面分析促进金葡菌蛋白酶活性基因对其预防及治疗具有重要作用。目的构建能用于转座子测序的突变文库,筛选及鉴定促进蛋白水解活性基因。方法采用基因合成及无缝克隆技术构建带有mariner转座酶的质粒pSATn,并使用脱水四环素红霉素诱导转座并富集形成突变文库。通过牛奶平板对金葡菌蛋白酶水解活性相关基因进行筛选并使用半随机PCR对转座子插入位点进行鉴定。结果成功构建转座子末端均带有MmeⅠ酶切位点金葡菌转座子突变文库,共筛选出26株蛋白酶缺陷克隆菌株,涉及22个基因。其中,新基因pde2转座子插入株显示蛋白水解活性减弱,生物被膜形成能力显著增强,大蜡螟幼虫致死能力显著降低的特征。结论本研究构建的转座子突变文库为后续转座子测序技术的开展奠定基础,为了解金葡菌蛋白水解活性调控的分子基础提供了新的见解,新筛选的基因pde2有望成为控制金黄色葡萄球菌感染的新靶标。

随机突变文库构建与筛选研究进展

定向进化是一个循环过程,在构建多样化基因序列和筛选功能基因变体之间交替进行。该技术目前已被广泛应用于DNA序列、基因功能和蛋白质结构的优化和分析。定向进化包括随机基因文库的生成、基因在合适宿主中的表达和突变文库的筛选。构建基因文库的关键是库容量和突变多样性,而筛选变体的关键是高灵敏度和高通量。文中讨论了定向进化技术的最新进展,这些新技术极大地加速和简化了传统的定向进化过程,为定向进化的发展注入了强劲动力。

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达,并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养,同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化,突变基因产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。

生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18 TnYLB-1突变体文库的构建

解淀粉芽孢杆菌Bs-18是一株对黄瓜白粉病具有显著防效的生防菌株,为深入研究此菌株的生防作用机理,本研究应用电击法构建了携带转座子Tn YLB-1的穿梭质粒p Mar A转化Bs-18的突变体文库。通过对转座温度和转座时间的筛选,筛选出50℃高温诱导16 h可获得最大转座成功率,并对突变体进行了PCR验证。Bs-18突变体文库的构建为研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用机制奠定了基础。

信号标签诱变突变体文库穿梭质粒构建

目的建立信号标签诱变突变体穿梭质粒,为构建信号标签诱变突变体文库及病原微生物毒力基因筛选打下基础。方法通过PCR扩增信号标签(signature tags,STs)片段,导入载体pC6,构建重组质粒pC6RS,转化到大肠杆菌CC118中,提取重组质粒后转化到大肠杆菌S17-1中。结果经过PCR、核苷酸序列测定鉴定,成功地构建了pC6RS质粒。

志贺菌福氏2a信号标签诱变突变体文库的构建

以合成的单链序列特异性标签为模板,通过PCR得到双链DNA标签并将其克隆到自杀质粒pUT-Tn5Km2的转座子中,转化大肠杆菌S17-1λpir;然后用经转化的S17-1λpir与福氏志贺菌2a2457T交配,挑出对氨苄青霉素敏感、对卡那霉素和萘啶酮酸抗性的菌落。结果表明构建了包含4376个福氏志贺菌突变体信号标签诱变文库,为进一步鉴定该病原体的毒力基因打下了基础。

酵母Ndi1p突变表达文库的建立和温度敏感株的筛选

Ndi1p(internal NADH脱氢酶)是酵母线粒体电子传递链的重要组成部分,参与酵母线粒体呼吸、凋亡等多种生理活动.本文成功建立了酵母Ndi1p突变表达文库,随机测序表明,每个基因平均含有2个突变.利用本文库进行了Ndi1p温度敏感突变筛选,获得了一定数量的温度敏感型菌株,并对温度敏感机理做了简单探索.结果表明,温度敏感酵母在需要Ndi1p脱氢酶活性的培养基上对温度敏感;有趣的是,这些温度敏感株细胞如果在30℃生长但在37℃测试不表现出温度敏感性,这暗示高温影响温度敏感Ndi1p的生成,正常温度下Ndi1p正确构象一旦生成则高温不能引起Ndi1p变性.Ndi1p突变表达文库的建立对于Ndi1p参与的细胞呼吸、凋亡等过程的机理研究将有一定意义.

玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建

构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制。将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50℃高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证。本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因。

水稻突变体文库及全长cDNA文库综述

主要对大型突变体文库、全长c DNA文库两方面进行介绍,并举例说明对作物遗传改良有影响的一些进展。

利用mini-Tn10转座子文库筛选鳗弧菌M3表型发生变化的基因

为了寻找影响鳗弧菌(Vibrio anguillarum)表型变化的基因,本研究使用转座子mini-Tn10(pLOF/Kana)构建了鳗弧菌M3突变株文库,筛选影响表型变化的菌株及相关基因,证明这些表型变化的突变子与毒力存在一定的相关性。对M3突变文库的1152突变子进行筛选,获得泳动能力改变的突变子1个(编号为6G_1),酪蛋白酶活性发生改变的突变子3个(编号为5A_11、7B_12和7E_12),明胶酶活性发生改变的突变子1个(编号为7H_1),以及菌膜形成能力发生显著变化的突变子3个(编号为5E_2、6A_2和6E_12)。对转座子插入位点进一步分析显示,一个磷酸二酯酶相关基因突变引起泳动能力增强(P<0.05),leuD、rseB和thiQ突变引起酪蛋白酶活性显著减弱(P<0.05),potD突变引起明胶蛋白酶活性显著减弱(P<0.05),leuO、ilvH和grpB的突变引起菌膜形成能力明显减弱(P<0.05)。对这些表型变化的突变子进行毒力感染,发现野生型M3是6G_1突变子的半数致死剂量(Lethal dose 50%,LD50)的2.04倍,该突变子毒力相对增强。5A_11、7B_12和7E_12的突变子LD50分别为野生型M3的2.96、3.25和3.36倍。7H_1的LD50是野生型M3的1.25倍,5E_2、6A_2和6E_12的LD50分别为野生型M3的3.34、4.08和1.84倍,这些突变子毒力相对减弱。本研究结果为进一步阐明鳗弧菌的发病机制提供了理论基础。

Lipocalin核糖体展示文库的构建及雌二醇特异性模拟抗体的筛选

[目的]构建Lipocalin核糖体展示文库,并筛选雌二醇特异性模拟抗体。[方法]以Lipocalin蛋白家族中的BBP(胆汁三烯结合蛋白)为模板,设计包含16个随机突变位点的引物,合成BBP基因文库;引入核糖体展示所必需的全部组件,采用重叠PCR技术将BBP库与核糖体展示组件进行拼接,构建核糖体展示Anticalin模拟抗体库;再将构建的Anticalin文库进行体外转录与翻译,产生模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体文库。以小分子抗原雌二醇为靶标,采用固相亲和方法筛选抗雌二醇抗体,通过改变Mg2+浓度将模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体解离,得到与模拟抗体对应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库并重新引入核糖体展示元件进行下一轮淘筛。[结果]通过5轮生物淘筛,模拟抗体得到富集,获得高特异性抗雌二醇抗体。其中有一株克隆的亲和力为54 mmol/L(Kon=4.975 6×104个/M·S;Koff=0.002 7个/S)。IC50与LOD值分别为50和0.071 ng/ml。[结论]获得的雌二醇模拟抗体可以作为抗体并用于检测动物体内雌二醇的残留。

MsiR高可溶性蛋白突变株的筛选

外源蛋白在表达宿主中的可溶性是影响其应用的关键因素。采用m Cherry报告基因,构建Msi R-m Cherry融合蛋白,通过测定荧光值定性定量的测定Msi R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。随后,利用易错聚合酶链反应(Errorprone-PCR)和致突变菌株(XL1-Red)两种方式构建了msi R-m Cherry基因突变文库,经筛选得到了4株在大肠杆菌中以37℃作为诱导温度下可溶性明显提高的蛋白突变体。

棉花黄萎病菌插入突变体库的构建及致病相关基因DVK1的克隆与鉴定

利用ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)技术自建Verticillium dahliae强致病力落叶型菌株T-DNA插入突变体库,共获得5000个转化子;随机挑选1000个转化子进行致病力鉴定,筛选获得5株致病力衰退的突变体。挑选致病力下降最为明显的突变体d1,通过TAIL-PCR技术最终获得一段长3237 bp的DVK1全长cDNA序列,编码1079个氨基酸的蛋白。基于DNA序列比对发现,DVK1基因含有2个内含子,分别为52 bp和36 bp。进一步比对发现T-DNA插入到DVK1基因启始密码上游740 bp的启动子中。通过遗传互补实验d1恢复了致病性,进一步证明DVK1基因与黄萎菌致病性相关。

一种基于构件重组建立超大容量DNA文库的方法

设计固定长度的随机序列,并在随机序列的末端加上共用接头作为标准构件,利用共用接头之间的互补连接,用重聚PCR的方法将标准构件进行随机组合,得到1个序列多样化的DNA文库。重聚优化的条件为:随机序列质量浓度18 ng/μL,重聚PCR退火温度27.8℃,终止引物浓度为随机序列浓度的1/40。文中方法的建立克服了目前突变体文库建立方法中强烈依赖起始基因的弊端,可以开拓更为广阔的序列空间。

利用EvolvR系统对酶基因实现多窗口定向进化的研究

EvolvR系统是一种CRISPR介导的新型定向进化技术,本研究探索其在酶基因序列定向进化中的适用性以及突变效率,同时在此基础上扩大EvolvR的突变窗口长度.研究成功将4个能高效表达的单个sgRNA串联,并检测到靶向同一基因的3个不同靶位点.证明EvolvR具有在目标基因区域大范围制造突变的潜力,具有很高的应用价值.为利用EvolvR系统对目标酶基因实现定向进化的研究奠定基础.

DNA家族改组技术的进展及应用

DNA家族改组(DNA family shuffling)是一项高效的体外进化技术,该技术利用自然界中具有同源序列的基因家族——如来自不同种属的相同基因以及同一种属的相关基因等进行改组,为蛋白质定向进化和结构——功能关系分析等研究提供了有效获得突变文库的方法。近年来,DNA家族改组技术不断取得新的发展,应用领域日益扩展,在生物合成途径的改造、植物抗病能力的加强、环境污染的治理、医药工业的发展、异源表达体系的建立等方面都发挥了重要作用。文章综述了这项技术在近年来的新发展和新应用,并展望了DNA家族改组技术的发展前景。