突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。

人突变K-ras基因修饰lewis肺癌细胞株的建立及其生物学特性

目的:探讨以K-ras基因为靶点,建立人K-ras(12位密码子点突变)基因修饰的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12及其生物学特性。方法:应用脂质体法将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,应用流式细胞仪检测p21/V12蛋白的表达,同时检测3LL细胞株转基因前后生长、克隆形成率和体内成瘤的变化。结果:成功的将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,p21/V12蛋白在3LL-pcDNA3-K-ras/V12中稳定表达,转基因细胞株的生长曲线和克隆形成率与原代细胞株3LL无显著差异;但转基因细胞株在C57BL/6小鼠体内的成瘤性显著高于原代细胞株3LL。结论:成功的建立了导入K-ras(12位密码子点突变)的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12。

子宫内膜癌与K-ras基因突变的研究

目的：分析子宫内膜癌组织中K-ras基因突变状况及其与Ras蛋白表达的相关性，从基因水平探讨K-ras基因在子宫内膜癌发病中的作用机制。方法：诊断明确的子宫内膜癌手术切除标本108例及同期因其他病因行刮宫术的正常子宫内膜。应用免疫组织化学染色法检测K-ras的表达，PCR扩增一直接测序法检测K-ras基因第2外显子12、13密码子突变，分析K-ras基因突变对Ras蛋白表达的影响及临床意义。结果：K—ras蛋白阳性表达率在子宫内膜癌明显高于正常子宫内膜；子宫内膜癌中K-ras基因突变率为33．3％；其中第12位密码子突变占75．0％，突变位点均位于K-ras基因第12位密码子第2位碱基上；第13位密码子突变率为25％，突变位点位于K-ras基因第13位密码子第1、2位碱基上。K-ras基因突变与Ras蛋白表达成正相关。结论：K—ras蛋白的阳性表达率可能是预示子宫内膜癌预后的一个因素，K—ras基因12密码子G—T和G—A突变是主要的突变方式。12密码子的突变可能为Ras蛋白增多的原因。

胰腺癌切除前后胰液K-ras基因点突变率变化的研究

对13例胰腺癌行胰十二指肠切除前后的胰液标本采用PCR－SSP检测K－ras基因有无穷变。结果发现：切除前胰液K－ras基因点突变率为100％，切除后第3日、第7日及第15日的胰液K－ras基因点突变率分别为15．4％（2／13）、0、0.研究表明：术前对收集的胰液行PCR－SSP检测K－ras有无穷变，有助于判断胰腺肿块的良恶性和胰腺癌的诊断，术后定期检测胶液，有助于及时发现多中心或复发病例，指导治疗，有利于康复。

利用激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K-ras和p53基因突变

[目的]探索激光捕获显微分离技术在检测肺癌病人K-ras和p53基因突变的应用。[方法]以3种不同的基因突变分析法对20例患者的痰细胞进行基因突变分析:①以PCR+DGGE方法分析K-ras基因突变,以PCR+SSCP方法分析p53基因突变;②以PCR+MAE+DGGE方法分析K-ras基因突变;以PCR+MAE+SSCP方法分析p53基因突变;③以激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K-ras和p53基因突变。[结果]在20例患者中,以现有的方法仅发现有15%(3/20)的基因突变,而激光捕获显微分离技术则发现有60%(12/20)的基因突变。[结论]激光捕获显微分离技术和突变分析法能高效灵敏检测肺癌病人痰细胞的K-ras和p53基因突变。

结直肠癌肝转移与门静脉血K-ras基因突变的关系

目的 检测结直肠癌患者门静脉血液、原发癌组织及肝转移灶中K-ras基因突变,探讨K-ras突变与结直肠癌肝转移的关系.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术和基因测序技术检测48例结直肠癌患者门静脉血液、原发肿瘤组织、相应的癌旁肠黏膜以及8例肝转移灶组织中K-ras基因突变.结果 48例结直肠癌组织中17例（35.4%）发现K-ras基因突变,48例癌旁黏膜中4例（8.3%）发现K-ras基因突变,明显低于癌组织的基因突变率（P＜0.05）.48例结直肠癌患者中16例（33.3%）门静脉血中发现K-ras基因突变,与癌组织的基因突变率差异无统计学意义（P＞0.05）.有肝转移患者门静脉血中K-ras基因突变率（7/10,70.0%）明显高于无肝转移者（9/38,23.7%,P＜0.05）.16例门静脉血存在K-ras基因突变者,其相应的肿瘤组织中均发现K-ras突变.而结直肠癌组织中无K-ras基因突变者,患者门静脉血及癌旁黏膜无基因突变.8例同时性肝转移患者中5例门静脉血发现K-ras基因突变,且其相应的肝转移灶组织也发现相同的K-ras突变.2例异时性肝转移患者门静脉血检测到K-ras基因突变,手术时无肝转移,但分别于术后第6个月和第9个月经CT检查证实有肝转移.原发肿瘤组织K-ras基因突变类型与门静脉血、肝脏转移灶的K-ras基因突变一致,即K-ras基因12密码子GGT突变为GAT或GTT.结论 结直肠原发癌组织和患者门静脉血有K-ras基因的突变,预示着肿瘤可能有肝脏转移.