大鼠脊髓损伤后三七总皂苷治疗增强脊髓损伤区突触分化诱导基因1(SynDIG1)的表达

目前对脊髓损伤的临床治疗仍是研究难题之一,主要是因为脊髓内的神经细胞再生修复能力较弱以及脊髓损伤后的微环境内出现大量神经生长抑制因子,特别是在脊髓损伤后由于炎症刺激神经突触囊泡导致谷氨酸大量释放,短时间内突触间隙的谷氨酸浓度急剧升高,致使神经细胞受到兴奋性毒性损伤,所以治疗脊髓损伤是采取药物治疗,减少神经生长抑制因子分泌,调整脊髓内神经细胞再生修复的微环境,有利于神经细胞的再生修复。

突触分化诱导基因SynDIG1的5′调控区序列的生物信息学分析

目的:研究突触分化诱导基因SynDIG1转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对获得SynDIG1基因5′调控区序列;利用模序识别分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural Network Promoter Prediction和PROMOTER 2.0分析SynDIG1基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件CpG Island Searcher分析SynDIG1基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析SynDIG1基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:SynDIG1基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box,没有GC-box和TATA-box;SynDIG1基因可能存在5个启动子位点;CpG岛为516bp区间(1 686～2 201bp);结果显示评分在85分以上(Score Threshold:85.0)时,该区域具有406个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上(Score Threshold:90.0)时,该区域具有168个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上(Score Threshold:95.0)时,该区域具有72个潜在的转录因子结合位点;评分在99分以上(ScoreThreshold:99.0)时,该区域具有28个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于SynDIG1基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义。

脊髓损伤后虫草素增强突触分化诱导基因1的表达

观察脊髓损伤后虫草素对脊髓组织内突触分化诱导基因1(SynDIG1)表达和神经系统运动功能的影响,探讨神经损伤修复的内在机制。将成年雌性SD大鼠随机分为对照组、损伤组、低剂量和高剂量治疗组,对照组不损伤脊髓,治疗组与损伤组行脊髓半横切损伤,随后治疗组给予虫草素处理,损伤组给予生理盐水处理。术后14、21、28、35 d用BBB和斜板试验评价大鼠肢体运动功能,并用免疫荧光和免疫印迹测定脊髓组织内SynDIG1活性。免疫荧光和免疫印迹结果均表明术后14 d损伤组和治疗组均有神经细胞SynDIG1表达,在28 d达到高峰,之后呈高水平表达,且SynDIG1水平在高剂量治疗组明显高于低剂量治疗组和损伤组,BBB和斜板试验评分在高剂量治疗组均明显高于低剂量治疗组和损伤组。虫草素明显改善损伤区域的微环境,激活神经系统的内源性修复机制,促进神经细胞SynDIG1大量表达,有利于神经系统运动功能恢复。

大鼠脊髓半切损伤后突触分化诱导基因产物SynDIG1的表达增强

目的探讨大鼠脊髓半切损伤后(spinal cord injury,SCI)突触分化诱导基因产物(synapse differentiation induced gene 1,Syn DIG1)的表达变化及意义。方法 SD大鼠随机分成对照组和脊髓损伤组(n=75),切断大鼠脊髓一半作为实验模型,只咬除椎板而不损伤大鼠脊髓作为对照模型。在手术后7、14、21、28、35天采集损伤区域的脊髓组织,用免疫荧光和免疫印迹技术检测各组各时间点Syn DIG1的蛋白表达,并且与半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、神经生长蛋白43(GAP-43)等神经元特异性标志物做免疫荧光双标技术检测。结果在脊髓损伤后第7天就发现神经元有SynDIG1表达,在第28天达到高峰,随后维持在较高水平。通过免疫荧光双标技术发现脊髓损伤后Syn DIG1与GAP-43存在共表达。结论脊髓损伤后中期神经元大量表达Syn DIG1,激活了神经生长因子,促进神经元再生,有利于神经系统的修复。

NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化

为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ,全反式维甲酸(ATRA)作用 0 ,12 ,2 4小时后每 μg总RNA中WT1基因的分子数分别为 4× 10 6,1.5 6× 10 6和0 .4× 10 6,与CD11b的变化情况相一致。结论提示 ,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关 。

CAMKⅡD基因在3T_(3^-)L_1脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化

目的 观察 3T3 L1前体脂肪细胞诱导分化过程中Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基 (CAMKⅡD)基因表达水平的变化 ,探讨CAMKⅡD基因与肥胖发生的关系。方法 体外培养 3T3 L1前体脂肪细胞 ,在诱导 3T3 L1脂肪细胞分化成熟的不同时段 ,采用RT PCR技术检测脂肪细胞中CAMKⅡD基因的mRNA表达水平。结果 诱导剂刺激后 (第 0天 ) ,3T3 L1脂肪细胞中CAMKⅡD基因的mRNA表达于第 1天显著下调 ,与第 0天比较具有显著差异 (P <0 .0 1) ;第 2天 ,该基因表达水平显著上调 ,并明显高于第 0天表达水平 (P <0 .0 1) ;第 2天至 3T3 L1细胞分化为成熟脂肪细胞 (第 10天 ) ,该基因表达一直维持在较高水平 (P >0 .0 5 )。结论 CAMKⅡD基因参与了脂肪细胞分化的调控 ,与肥胖发生相关 ,其在3T3

TGF-β诱导早期基因1对MG-63细胞成骨分化能力的调控作用及其机制

目的探讨TGF-β诱导早期基因1(TIEG1)在MG-63细胞成骨分化过程中的作用及可能机制。方法将表达抑制TIEG1基因的shRNA质粒用Lipofectamine2000转染到MG-63细胞中,筛选出稳定表达shRNA细胞株即MG-63/TIEG1 KD细胞。用实时定量PCR法和Western blotting法检测MG-63/TIEG1 KD细胞与正常MG-63(MG-63/WT)细胞TIEG1基因及蛋白表达,以验证TIEG1的敲减效果。用成骨分化培养液诱导MG-63/WT及MG-63/TIEG1 KD细胞分化4周,检测两种细胞碱性磷酸酶(ALP)分泌活性及形成的矿化结节,比较二者分化矿化能力的差异。之后将两种细胞用成骨分化培养液培养7 d后收集细胞,实时定量PCR法、Western blotting法检测成骨分化标志物Runx2及Wnt信号通路下游核心分子β-catenin表达;免疫荧光观察β-catenin蛋白表达情况及细胞定位。结果建立了稳定TIEG1敲减的细胞株MG-63/TIEG1 KD,其TIEG1 mRNA和蛋白表达量低于MG-63/WT细胞(P均<0.05)。诱导分化后,MG-63/TIEG1 KD的ALP分泌活性及矿化结节形成能力均低于MG-63/WT细胞(P均<0.05),其Runx2、β-catenin的mRNA及蛋白表达量均低于MG-63/WT细胞(P均<0.05)。结论TIEG1通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进MG-63成骨分化及矿化形成能力。

蟾蜍灵诱导白血病HL-60细胞分化及相关基因表达

目的 研究中药蟾酥中蟾毒成分蟾蜍灵 ( bufalin)的抗癌机制。方法 以早幼粒白血病 HL - 60细胞为靶细胞 ,应用电镜技术观察 bufalin诱导的细胞分化 ,免疫组化方法检测增殖细胞核抗原 ( PCNA)和细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子 p2 1WAF1 的表达。结果 0 .0 0 1μmol/ L bufalin作用 HL - 60细胞 ,细胞向粒细胞方向分化 ,p2 1WAF1表达显著升高 ,而 PCNA表达显著下降 ,二者呈显著负相关 ( P<0 .0 1)。结论 bufalin诱导 HL- 60细胞分化 ,与其上调 p2 1WAF 1的表达、下调 PCNA表达有关。

脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞(UBC-MNCs)体外向神经干细胞(NSCs)的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC-MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasal培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12 d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC-MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高(P<0.05),6 d达高峰,之后逐渐下降(P<0.05)。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。

二烯丙基二硫下调DJ-1抑制人白血病HL-60细胞增殖及诱导分化

目的研究二烯丙基二硫(DADS)通过下调DJ-1对人白血病细胞系HL-60增殖抑制及诱导分化的影响。方法通过细胞形态法观察细胞分化;Western blot及免疫细胞化学检测DADS对HL-60细胞DJ-1表达的影响;针对DJ-1mRNA序列设计合成siRNA转染人白血病细胞HL-60,Western blot检测基因干扰效果;利用MTT法及间接免疫荧光检测DADS及DJ-1沉默对HL-60细胞的生长及细胞分化的影响。结果 DADS可以诱导HL-60细胞向成熟粒细胞系样分化。DADS呈时间依赖性抑制DJ-1的表达(P<0.05),DJ-1干扰组细胞生长减慢(P<0.05),与DADS共同作用后可诱导HL-60细胞分化。检测细胞生长情况发现干扰组细胞生长减慢(P<0.05)。结论 DADS通过下调DJ-1抑制细胞增殖并诱导HL-60细胞分化;干扰DJ-1基因可以增强DADS对HL-60细胞的增殖抑制诱导分化作用。

IGF2基因印记丢失对胚胎干细胞向胰岛样细胞诱导分化的影响

背景:IGF2是一种重要的胚胎有丝分裂生长促进因子,在维持细胞正常生长过程中起关键作用,其基因表达以基因组印迹方式受表观遗传调控。当IGF2发生印迹丢失时,与个体的非正常发育以及肿瘤发生存在一些联系。目的:探讨IGF2基因发生印记丢失对小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞的影响。方法:体外诱导2种小鼠胚胎干细胞(SF1-G和SF1-1)向胰岛样细胞分化;Real-Time PCR和细胞免疫荧光检测Insulin基因的表达;聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测印迹基因IGF2在诱导分化前后细胞中的亲本表达;体外胰岛素释放实验检测诱导终末细胞的胰岛素释放水平。结果与结论:(1)IGF2基因印记正常(SF1-G)和印记丢失(SF1-1)的2种小鼠胚胎干细胞在诱导分化前后印迹状态没有发生改变;(2)在诱导的终末细胞中,尽管2种细胞的胰岛素释放水平差异无显著性意义,但是Insulin基因在SF1-1组中的表达水平要高于其在SF1-G组的表达水平;(3)IGF2基因印记丢失可能与诱导分化来源的终末细胞中Insulin基因的表达上调相关。

LIM矿化蛋白1/低氧诱导因子1α慢病毒载体转染脂肪源性干细胞的成骨分化

背景:LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α作为胞内蛋白,可分别从诱导成骨分化及促进血管再生两个方面促进成骨,联合二者高效诱导脂肪源性干细胞成骨分化具有重要的意义。目的:探讨慢病毒载体介导的LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染的脂肪源性干细胞成骨分化的情况。方法:应用反转录PCR技术克隆目的基因LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α片段,并分别克隆于慢病毒骨架质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg和p LVX-EF1α-IRES2-AcG FP1中,构建慢病毒载体主体质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-AcG FP-RHIF-1α,随即与辅助质粒和包装质粒共转染Lenti-X 293T细胞,包装慢病毒载体;采用组织块加酶消化法分离培养大鼠脂肪源性干细胞,使用流式细胞仪对其进行鉴定。分别在慢病毒转染脂肪源性干细胞3,7,14 d后,应用反转录PCR方法检测脂肪源性干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平的同时检测血管内皮生长因子的表达水平。结果与结论:pL VX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-Ac GFP-RHIF-1α可有效地转染入大鼠脂肪源性干细胞;反转录PCR结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白在LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染后第7天都开始明显过表达,并且可持续到14 d。说明LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染脂肪源性干细胞可提高其成骨活性。

视黄酸诱导基因1样受体(RLR)识别和调控的研究进展

天然免疫系统通过模式识别受体(PRR)识别病毒、细菌等病原体的病原体相关分子模式(PAMP),进而启动天然免疫反应、帮助机体清除入侵病原体。视黄酸诱导基因1(RIG-1)样受体(RLR)是PRR中具有DEx D/H-box RNA解螺旋酶结构域的一类受体,目前发现的RLR包括视黄酸诱导基因1(RIG-1/DDX58)、黑素瘤分化相关分子5(MDA5/IFIH1)和遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2/DHX58)。它们参与多种机体生理和病理过程,如抗病毒反应、自身免疫性疾病、肿瘤,其主要功能是识别病毒的寡聚核糖核苷酸,激活线粒体抗病毒信号蛋白[MAVS(IPS-1/VISA/cardif)]等关键接头分子,最终导致转录因子干扰素诱导因子3(IRF3)和核因子κB(NF-κB)活化,诱导1型干扰素和炎性细胞因子,从而介导宿主抗病毒免疫。本文重点阐述RLR在抗病毒免疫反应中识别RNA机制的研究进展。

干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1 shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组。使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Western blot检测β-catenin蛋白表达水平。结果与结论:(1)与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;(2)干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力。

小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性

【目的】探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。【方法】培养小鼠骨髓干细胞,采用含GLP-1和nicotinamide的无血清培养液诱导分化,在培养过程中,检测有关基因的表达。【结果】培养的小鼠骨髓干细胞具有与文献报道相似的生物学特性;在诱导分化第7天,有ngn3和pdx-1基因表达;在诱导分化第14天,有nkx2.2、pdx-1和ins2基因表达。【结论】小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性,值得进一步研究。

HIF-1α基因修饰的牙髓干细胞成血管的体外研究

目的 :探讨低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)基因对体外诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成血管分化方法并进行鉴定。方法 :取拔除的健康、完整的前磨牙标本20例,提取DPSCs细胞,采用Strol-1、CD146分子进行鉴定。根据DPSCs是否转染HIF-1α基因分为实验组和对照组,RT-PCR法测定HIF-1αm RNA表达,Western印迹检测培养1、4、7、14 d不同时间段HIF-1α及成血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2及PDGF的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 :倒置相差显微镜观察,DPSCs多数细胞呈圆形、椭圆形类,免疫荧光观察到Strol-1、CD146均呈绿色荧光。实验组HIF-1α蛋白、m RNA随着时间的延长,表达水平越来越高,差异显著(P<0.05)。实验组转染后1、4、7、14 d后与对照组相比,HIF-1α蛋白、m RNA显著增高(P<0.05)。对照组血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随时间的延长,其表达水平无显著差异(P>0.05)。实验组VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随培养时间延长,其表达水平逐渐升高,不同时间点间差异显著(P<0.05)。与对照组相比,转染后1、4、7、14 d差异显著(P<0.05)。结论:HIF-1α基因修饰DPSCs能够成功体外诱导其血管分化作用,为进一步血管形成研究奠定了基础。

缺氧诱导因子-1α与前列腺癌生物学行为的关系

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF1α)与前列腺癌侵袭转移、分化增殖及凋亡的关系。方法采用免疫组化方法检测40例前列腺癌和10例前列腺增生(BPH)中HIF1α与增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤基因2(Bcl2)、CD34的表达及计算微血管密度(MVD)。结果前列腺癌中HIF1α的表达明显高于BPH;HIF1α在前列腺癌中的表达水平与前列腺癌的病理分级和临床分期均呈正相关;前列腺癌中HIF1α的表达与PCNA及MVD呈正相关,与Bcl2呈负相关。结论HIF1α水平升高在前列腺癌的发生、发展过程中可能起重要作用;HIF1α的表达水平可用于预测前列腺癌的生物学行为,可作为前列腺癌治疗的新靶点。

氯化高铁血红素诱导K562细胞红系定向分化细胞模型的构建

目的研究氯化高铁血红素（Heroin）诱导K562细胞红系定向分化的效果及血红蛋白含量、FUT1基因表达变化，构建K562细胞红系定向分化模型。方法50μmol／LHemin作用于K562细胞1～7d，测联苯胺染色阳性率，RT—PCR法检9n,4FUT1基因mRNA表达量变化；5～7d分为持续诱导组和无诱导组，以Heroin诱导前1d．0h为对照组，检测两组联苯胺染色阳性率及FUT1基因mRNA表达量变化。结果Hemin持续诱导K562细胞第1～7天，联苯胺染色阳性率在4d达高峰，后逐步下降；3、4、5d联苯胺染色阳性率之间比较差异无统计学意义（F=28．55，P〉0．05）。5—7d持续诱导、无诱导两组间比较，联苯胺染色阳性率差异有统计学意义（F=22．001，P〈0．05）。Hemin诱导1～7d的FUTlmRNA相对表达量分别为对照组的0．667±0．004、0．616±0．006、0．615±0．029、1．138±．049、0．66±0．002、0．752±0．029、0．674±0．014倍。结论Hemin可诱导I（562细胞红系定向分化，K562细胞经Heroin诱导第4天联苯胺染色阳性率、FUT1基因mRNA表达量最高。选择诱导3d的K562细胞为模型，持续Hemin诱导，进行人工干预FUT1基因表达的研究，为ABO血型不合移植适应性调节研究奠定实验基础。

N-myc下游调节基因1-NDRG1

N-myc下游调节基因1 （N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1）属于NDRG家族,α/β水解酶超家族,但无水解酶催化位点.研究表明[1],该基因与细胞生长发育[2]、肿瘤细胞生长和转移均有关,同时还参与了应激反应[3]、脂类的生物合成、髓鞘的形成以及组织的缺氧过程等;可被多种分化调节剂诱导表达,譬如在诱导分化剂维甲酸、巴豆油、佛波酯等的作用下,NDRG1 mRNA及蛋白表达上调[4].因而对该基因的深入研究,可进一步阐明肿瘤诱导分化治疗的分子生物学机制.

高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用

背景:胰岛细胞移植是治疗1型糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。多能干细胞有望成为胰岛细胞移植的理想种子细胞,但其向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。目的:构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体,探讨其实时监测诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化中关键性基因表达的可行性。方法:首先在pT iger载体上引入嘌呤霉素抗性,然后以646 bp的小鼠Ins1启动子替换了原来载体上410 bp的小鼠Ins1启动子,获得高效Pdx1/insulin双报告基因载体。最后,将载体导入INS-1细胞和诱导多能干细胞,验证其功能。结果与结论:(1)实验成功构建了高效Pdx1/insulin双报告基因载体;(2)在INS-1细胞中验证了载体获得嘌呤霉素抗性,提高了insulin表达效率,并在INS-1细胞中检测到Pdx1和insulin的表达;(3)实验初步证明了Pdx1/insulin双报告基因能够有效监测细胞分化过程中Pdx1和insulin基因的表达。