突触小体相关蛋白SNAP25的原核表达、纯化及鉴定

目的:克隆突触小体相关蛋白(SNAP25)基因,原核表达、纯化并鉴定SNAP25蛋白。方法:PCR扩增SNAP25基因,克隆至表达质粒pTIG-Trx,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western印迹分析肉毒神经毒素BoNT/A轻链对该蛋白的裂解情况。结果:构建了pTIG-SNAP25表达质粒,经IPTG诱导表达,目的蛋白占全菌蛋白的26.2%,表达形式为可溶性表达,表达量达115.4mg/L,纯化后蛋白纯度达95%以上;经SDS-PAGE及Western印迹分析,SNAP25蛋白可被BoNT/A轻链特异降解。结论:克隆了SNAP25基因,在原核系统中表达、纯化并鉴定了重组SNAP25蛋白。

溃疡性结肠炎大鼠结肠肌层突触小体相关蛋白25的表达变化

目的:观察溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠肌层分子量为25 kDa的突触小体相关蛋白(synaptosomal associated protein of 25kDa,SNAP-25)的表达情况.方法:应用2,4-二硝基苯磺酸(2,4-dinitrobenzene sulfonic acid,DNBS)灌肠的方法制作大鼠UC模型,免疫组织化学评估结肠肌层SNAP-25标记的神经轴突的密度,Western blot半定量检测肌层SNAP-25含量,HE染色法评价结肠炎症状态,生化检测方法评价结肠匀浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力及丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量的变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测白介素1円(interleukin1円,IL-1円)含量的变化.结果:在DNBS诱导的UC大鼠,结肠肌层中SNAP-25标记的轴突密度减小为对照的22.60%(23.76个/百个平滑肌细胞±13.24个/百个平滑肌细胞vs 5.37个/百个平滑肌细胞±1.96个/百个平滑肌细胞,P<0.01),肠道肌层SNAP-25蛋白表达量减少为对照组的34.31%(P<0.01).与对照组相比,结肠组织中MPO活力增高(1.91 U/g wet weight±0.58U/g wet weight vs 0.99 U/g wet weight±0.21U/g wet weight,P<0.01),SOD活力显著降低(4.11 U/mg protein±1.80 U/mg protein vs 9.01U/mg protein±2.17 U/mg protein,P<0.01),MDA含量增高(1.72 nmol/mg protein±0.28nmol/mg protein vs 1.11 nmol/mg protein±0.27 nmol/mg protein,P<0.01),IL-1円表达量增高(181.51 pg/mg protein±55.30 pg/mg protein vs 84.27 pg/mg protein±42.27 pg/mg protein,P<0.01).结论:DNBS诱导的UC大鼠的结肠肌层SNAP-25蛋白表达量明显减少,肠道组织炎症及氧化应激水平增高可能是其重要原因之一.

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。

突触小体相关蛋白-25在神经退行性疾病中的研究进展

突触功能障碍是神经退行性疾病中神经退行性变的重要病理机制之一,检测突触蛋白生物标志物在判定疾病进展及监测疾病修饰药物的临床疗效中具有重要价值。突触小体相关蛋白-25是突触前质膜蛋白,能准确反映神经退行性疾病中发生的突触损伤,是目前十分有前景的评估突触功能的生物标志物。本文现围绕突触小体相关蛋白-25的基本特征、功能及其在阿尔茨海默病、帕金森病、路易体相关痴呆等神经退行性疾病中的研究进展进行综述,以期为在临床前阶段早期识别高危患者的病理改变、监测患者病情进展以及开发新的治疗靶点提供参考依据。

突触小体相关蛋白-25基因多态性与精神分裂症相关研究

目的研究突触小体相关蛋白-25（SNAP-25）基因3端翻译区单核苷酸多态性（SNP）位点rs8636与精神分裂症的关系。方法采用聚合酶连反应-限制性片段长度多态性技术，检测300例精神分裂症患者（患者组）和300例正常对照（对照组）的基因型及基因频率。分析SNAP-25基因多态性与精神分裂症的相关性。结果①患者组与对照组rs8636多态性位点的等位基因和基因型的频数分布均符合Hardy—Weinberg平衡检验（Х^2=2．69，v=1，P〉0．05；Х^2=2．52，13=1，P〉0．05）。②患者组与对照组SNAP-25基因rs8636多态性位点的基因型和等位基因频率的总体分布差异有统计学意义（Х^2=6．454，P〈0．05；Х^2=7．033，P〈0．05）；③患者组C／C基因型频率（65．0％）和C等位基因频率（79．7％）高于对照组，差异有统计学意义（Х^2=5．848，P〈0．05；OR=1.50）；患者组T／T基因型频率（5．7％）略低于对照组，差异无统计学意义（Х^2=2．453，P〉0．05）。结论SNAP-25基因rs8636多态性位点与精神分裂症可能存在关联。C／C基因型和C等位基因可能是精神分裂症发病的危险因素。

利用荧光共振能量转移方法研究Snap23和Munc 18C在CHO细胞中的相互作用

目的研究突触小体相关蛋白(snaptosome associated protein of 23 KD,Snap23)与Munc 18C蛋白的相互作用。方法从人肌肉组织中钓取人Snap23基因并克隆入pEYFP-N1载体中,构建pEYFP-Snap23质粒,瞬时转染入CHO细胞后荧光显微镜观察并拍照,免疫蛋白印迹检测EYFP-Snap23蛋白的表达。共转染pEYFP-Snap23和PECFP-Munc 18c质粒,利用荧光共振能量转移的方法检测二者是否有相互作用,同时共转染pEYFP-Snap23和pECFP-N1作为对照组。结果成功构建pEYFP-Snap23载体,荧光共振能量转移实验证明Snap23与Munc 18C蛋白有相互作用。结论突触小体相关蛋白Snap23可能与Munc 18C相互作用。

不同类型细胞对A型肉毒毒素效价检测的可行性分析

目的 分析4种连续细胞和1种人神经元细胞对A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)效价检测的适用性,为高敏感性BoNT/A细胞检测方法的建立提供依据。方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcriptase chain reaction, qRT-PCR)对4种连续细胞中BoNTs毒性相关蛋白受体和N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, SNARE)进行定量检测,并用Western blot评估4种连续细胞和1种人神经元细胞对BoNT/A的敏感性。结果 qRT-PCR结果显示,4种连续细胞中除突触囊泡蛋白2B(synaptic vesicle protein 2B,SV2B)不表达或表达量较低外,其他BoNTs相关蛋白受体和SNARE蛋白均有较高的表达。Western blot结果显示,4种连续细胞对BoNT/A的敏感性依次为人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y5Y)、人神经母细胞瘤细胞[BE(2)-M17]。在SK-N-SH中,孵育0.1 mg/mL的三唾液神经节苷脂GT1b(Trisialoganglioside GT1b, GT1b),5 000 U/mL BoNT/A可切割45%突触小体相关蛋白25(synaptosome-associated protein of 25 000,SNAP25)。Western blot检测发现,1种人神经元细胞对BoNT/A较敏感,在约100 U/mL时达到50%的SNAP25裂解。结论 人神经元细胞敏感性优于其他4种连续细胞,在建立BoNT/A细胞学检测方法中具有一定的潜力。

A型肉毒毒素内肽酶免疫检测方法的建立

目的建立一种A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。方法首先构建参考底物蛋白SNAP251-197质粒并表达纯化,合成检测目标8肽序列且于兔体内制备并纯化其抗体;96孔板包被底物蛋白,利用ELISA方法建立A型肉毒毒素生物活性定量检测体系,并对检测方法的检测限、重复性及精密度等因素进行评价。结果成功表达纯化了SNAP251-197底物蛋白,制备并纯化了8肽兔多抗,建立了BoNT/A ELISA检测体系。结论成功建立了一种简便、灵敏、快速、稳定、可靠的A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。

C型肉毒毒素的研究进展

C型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type C,BoNT/C)通常与引起动物的食源性肉毒中毒相关,目前尚未发现人类肉毒中毒的相关病例报道。BoNT/C进入神经元细胞可以裂解突触小体相关蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25000,SNAP-25)和突触融合蛋白(syntaxin)。现对BoNT/C的口服毒性及肠上皮细胞的黏膜免疫;神经节苷脂作为神经毒素进入神经元细胞的双受体转运结合机制,以及对BoNT/C应用于临床靶向治疗神经母细胞瘤的进展作一概述。