突触相关蛋白25在成年期甲状腺功能减退症大鼠额叶内表达变化及甲状腺素治疗效应

目的研究成年期甲状腺功能减退症(甲减)大鼠额叶内突触相关蛋白25(SNAP-25)的表达及甲状腺素替代治疗后的恢复状况,探讨甲减脑损伤及恢复的分子基础。方法用丙基硫氧嘧啶(PTU)建立成年期大鼠甲减模型,采用放射免疫法测定甲减组、常规剂量甲状腺素替代治疗组、大剂量甲状腺素替代治疗组、健康对照组大鼠的血清甲状腺素水平,免疫组织化学方法分析四组大鼠额叶内SNAP-25蛋白的表达情况。结果与健康对照组相比,甲减组大鼠血清T3、T4水平显著减低(P<0.02);常规剂量(5μg.kg-1.d-1)替代治疗后,血清T3、T4恢复至正常水平。甲减组额叶I、II、III、IV、V层SNAP-25蛋白的表达水平显著高于健康对照组(P<0.01);常规剂量替代治疗组SNAP-25表达水平与健康对照组比较未见明显差异;与甲减组相比,大剂量(20μg.kg-1.d-1)替代治疗组SNAP-25表达水平在额叶各层显著减低(P<0.05)。结论成年期甲减大鼠额叶SNAP-25蛋白表达增多,常规及大剂量甲状腺素替代治疗后均可降低该蛋白表达,大剂量替代治疗后SNAP-25表达水平更接近正常。

溃疡性结肠炎大鼠结肠肌层突触小体相关蛋白25的表达变化

目的:观察溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠肌层分子量为25 kDa的突触小体相关蛋白(synaptosomal associated protein of 25kDa,SNAP-25)的表达情况.方法:应用2,4-二硝基苯磺酸(2,4-dinitrobenzene sulfonic acid,DNBS)灌肠的方法制作大鼠UC模型,免疫组织化学评估结肠肌层SNAP-25标记的神经轴突的密度,Western blot半定量检测肌层SNAP-25含量,HE染色法评价结肠炎症状态,生化检测方法评价结肠匀浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力及丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量的变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测白介素1円(interleukin1円,IL-1円)含量的变化.结果:在DNBS诱导的UC大鼠,结肠肌层中SNAP-25标记的轴突密度减小为对照的22.60%(23.76个/百个平滑肌细胞±13.24个/百个平滑肌细胞vs 5.37个/百个平滑肌细胞±1.96个/百个平滑肌细胞,P<0.01),肠道肌层SNAP-25蛋白表达量减少为对照组的34.31%(P<0.01).与对照组相比,结肠组织中MPO活力增高(1.91 U/g wet weight±0.58U/g wet weight vs 0.99 U/g wet weight±0.21U/g wet weight,P<0.01),SOD活力显著降低(4.11 U/mg protein±1.80 U/mg protein vs 9.01U/mg protein±2.17 U/mg protein,P<0.01),MDA含量增高(1.72 nmol/mg protein±0.28nmol/mg protein vs 1.11 nmol/mg protein±0.27 nmol/mg protein,P<0.01),IL-1円表达量增高(181.51 pg/mg protein±55.30 pg/mg protein vs 84.27 pg/mg protein±42.27 pg/mg protein,P<0.01).结论:DNBS诱导的UC大鼠的结肠肌层SNAP-25蛋白表达量明显减少,肠道组织炎症及氧化应激水平增高可能是其重要原因之一.

突触小体相关蛋白SNAP25的原核表达、纯化及鉴定

目的:克隆突触小体相关蛋白(SNAP25)基因,原核表达、纯化并鉴定SNAP25蛋白。方法:PCR扩增SNAP25基因,克隆至表达质粒pTIG-Trx,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western印迹分析肉毒神经毒素BoNT/A轻链对该蛋白的裂解情况。结果:构建了pTIG-SNAP25表达质粒,经IPTG诱导表达,目的蛋白占全菌蛋白的26.2%,表达形式为可溶性表达,表达量达115.4mg/L,纯化后蛋白纯度达95%以上;经SDS-PAGE及Western印迹分析,SNAP25蛋白可被BoNT/A轻链特异降解。结论:克隆了SNAP25基因,在原核系统中表达、纯化并鉴定了重组SNAP25蛋白。

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。

突触小体相关蛋白-25在神经退行性疾病中的研究进展

突触功能障碍是神经退行性疾病中神经退行性变的重要病理机制之一,检测突触蛋白生物标志物在判定疾病进展及监测疾病修饰药物的临床疗效中具有重要价值。突触小体相关蛋白-25是突触前质膜蛋白,能准确反映神经退行性疾病中发生的突触损伤,是目前十分有前景的评估突触功能的生物标志物。本文现围绕突触小体相关蛋白-25的基本特征、功能及其在阿尔茨海默病、帕金森病、路易体相关痴呆等神经退行性疾病中的研究进展进行综述,以期为在临床前阶段早期识别高危患者的病理改变、监测患者病情进展以及开发新的治疗靶点提供参考依据。

安神定志灵对大鼠脑突触体多巴胺释放相关因子表达的影响

目的研究安神定志灵对突触相关蛋白25(SNAP25)、突触融合蛋白1a(Synataxin 1a)的调控作用,从多巴胺释放途径探讨安神定志灵治疗注意力缺陷多动障碍(ADHD)的作用机制。方法自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)随机分为模型组,盐酸哌甲酯组(10.5μg·kg^(-1)),安神定志灵低、中、高剂量(6.75,13.35,26.70 g·kg^(-1))组,每组10只,另取10只正常血压大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)作为正常组,连续灌胃给药4周。采用Percoll密度梯度离心法制备脑突触体;采用Western Blot法检测突触体SNAP25、Synataxin 1a蛋白表达;Real-time PCR法检测SNAP25、Synataxin 1a m RNA表达;免疫组化法检测纹状体SNAP25、Synataxin 1a阳性细胞表达。结果与正常组比较,模型组大鼠脑突触体SNAP25及Synataxin 1a的蛋白、m RNA、阳性细胞表达量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,各给药组的SNAP25、Synataxin 1a蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05,P<0.01);安神定志灵低、中剂量组的Synataxin1a m RNA相对表达量显著升高(P<0.05,P<0.01),安神定志灵中、高剂量组的SNAP25 m RNA相对表达量亦显著上调(P<0.01);安神定志灵低、中剂量组的Synataxin 1a阳性细胞表达量显著升高(P<0.01),安神定志灵中、高剂量组的SNAP25阳性细胞表达量亦显著升高(P<0.01)。结论安神定志灵能够显著改善SHR大鼠脑内SNAP25、Synataxin 1a的表达,其治疗ADHD的药效机制可能与调控多巴胺释放因子相关。

SNAP25MnlI多态性与儿童注意缺陷多动障碍关联性的meta分析

目的:评价突触相关蛋白25基因(SNAP25)MnlI多态性与儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)的关联性。方法:检索Pubmed、Embase、Web of Science、Google Scholar、中国知网、维普全文电子期刊、万方数据库和中国生物医学文献数据库,检索时限均为自建库至2019年11月,搜集SNAP25MnlI多态性与ADHD相关的研究。结果:本研究包含7项病例对照研究和8项传递不平衡检验。Meta分析显示,存在中度异质性(I^2=45.6%),因此采用随机效应模型分析,结果支持SNAP25MnlI多态性与儿童ADHD存在关联[OR(95%CI)=1.16(1.03~1.30),P<0.05]。按人种及研究类型进行亚组分析后,得到在白种人、病例对照研究中SNAP25MnlI多态性与儿童ADHD风险存在关联[OR(95%CI)=1.10(1.00~1.22)、1.38(1.11~1.70),均P<0.05]。结论:本研究提示在白种人中或采用病例对照研究的实验方法表明SNAP25MnlI多态性可能会增加儿童ADHD的风险。

突触小体相关蛋白-25基因多态性与精神分裂症相关研究

目的研究突触小体相关蛋白-25（SNAP-25）基因3端翻译区单核苷酸多态性（SNP）位点rs8636与精神分裂症的关系。方法采用聚合酶连反应-限制性片段长度多态性技术，检测300例精神分裂症患者（患者组）和300例正常对照（对照组）的基因型及基因频率。分析SNAP-25基因多态性与精神分裂症的相关性。结果①患者组与对照组rs8636多态性位点的等位基因和基因型的频数分布均符合Hardy—Weinberg平衡检验（Х^2=2．69，v=1，P〉0．05；Х^2=2．52，13=1，P〉0．05）。②患者组与对照组SNAP-25基因rs8636多态性位点的基因型和等位基因频率的总体分布差异有统计学意义（Х^2=6．454，P〈0．05；Х^2=7．033，P〈0．05）；③患者组C／C基因型频率（65．0％）和C等位基因频率（79．7％）高于对照组，差异有统计学意义（Х^2=5．848，P〈0．05；OR=1.50）；患者组T／T基因型频率（5．7％）略低于对照组，差异无统计学意义（Х^2=2．453，P〉0．05）。结论SNAP-25基因rs8636多态性位点与精神分裂症可能存在关联。C／C基因型和C等位基因可能是精神分裂症发病的危险因素。

SNAP25基因多态性对氨磺必利治疗精神分裂症PANSS评分的影响

尽管目前抗精神分裂症药物的副作用已经大大减少,但是许多精神分裂症患者的治疗效果仍然难以令人满意[1],导致患者的症状加重出现功能障碍等严重后果。抗精神分裂症药物的临床疗效可能因个体差异而产生不同,因此药物遗传学研究对于精神分裂症的的治疗显得尤为重要[2]。Muller等[3]报道突触相关蛋白25kDa(synaptosomal associated protein of 25KD,SNAP25)基因与抗精神病药物反应相关,发现rs8636位点基因多态性与高加索人精神分裂症患者药物治疗反应有关。

甲状腺激素对成年大鼠额叶内synaptotagmin 1及SNAP-25表达的影响

目的观察成年期甲状腺功能减退症(简称甲减)大鼠额叶内突触结合蛋白1(Syt-1)及突触相关蛋白SNAP-25(synaptosomal associated protein of 25KD)的改变及左旋甲状腺素(T4)替代治疗后的恢复状况,探讨甲减脑损伤及恢复可能的分子机制。方法药物建立成年期大鼠甲减及治疗模型,放射免疫法测定血清甲状腺激素水平,Western blot法观察Syt-1和SNAP-25在大鼠额叶的表达。结果与对照组相比,甲减组大鼠血清T3、T4水平显著降低(P<0.05),额叶突触小体内Syt-1的表达水平显著低于对照组,SNAP-25的表达水平显著高于对照组(P<0.05);T4替代治疗组与对照组比较血清T3、T4无统计学差异;Syt-1及SNAP-25的表达无统计学差异(P>0.05)。结论成年期甲减大鼠额叶内Syt-1表达减少,SNAP-25表达增加,甲状腺素治疗能使其恢复。

氟对大鼠海马中SNAP-25基因表达的影响

通过建立氟中毒大鼠模型,研究一定剂量氟化钠下大鼠海马中氟突触体相关蛋白-25(SNAP-25)基因表达量,为探讨氟对神经系统造成的影响提供动物性试验依据。结果表明,与饮用去离子水组相比,染氟突触体相关蛋白-25基因mRNA的表达明显下调。

黄芩苷对自发性高血压大鼠突触体多巴胺释放相关因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对突触相关蛋白25(SNAP25)、突触结合蛋白1α(Synataxin 1α)及囊泡转运蛋白Ⅱ型(VMAT2)的调控作用及对脑内多巴胺含量的影响,从多巴胺释放途径探讨黄芩苷治疗注意缺陷多动障碍(ADHD)的作用机制。方法:依据随机数字将幼年自发性高血压大鼠(SHR)分为模型组,盐酸哌甲酯组,黄芩苷低、中、高剂量组,每组8只,另设WKY大鼠8只为正常组,分别灌胃4周,每日记录大鼠体质量及进食量的变化。Percoll密度梯度离心法制备脑突触体,运用Western blot法检测SNAP25、Synataxin 1α、VMAT2蛋白的表达;运用PCR技术检测SNAP25、VMAT2、Synataxin 1αm RNA表达水平;高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠前额叶、纹状体多巴胺的含量。结果:黄芩苷不影响大鼠的体质量及进食量;盐酸哌甲酯及黄芩苷高剂量均能够显著上调SNAP25、Synataxin 1α及VMAT2蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。黄芩苷中、高剂量及盐酸哌甲酯能够显著提高SHR大鼠突触体内SNAP25、Synataxin 1α及VMAT2 m RNA的表达量(P<0.05,P<0.01)。前额叶多巴胺含量检测结果显示,与正常组比较,模型组DA含量升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸哌甲酯组前额叶多巴胺含量显著增高(P<0.01),黄芩苷各剂量组无显著差异。纹状体多巴胺含量检测结果显示,与正常组比较,模型组DA含量升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸哌甲酯组及黄芩苷高、中剂量组含量显著增高(P<0.01,P<0.05)。结论:黄芩苷不影响大鼠的正常生长,且黄芩苷能够上调SNAP25、Synataxin 1α及VMAT2蛋白及m RNA的表达,影响纹状体多巴胺的含量,黄芩苷的这一作用可能存在剂量相关性。

不同类型细胞对A型肉毒毒素效价检测的可行性分析

目的 分析4种连续细胞和1种人神经元细胞对A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)效价检测的适用性,为高敏感性BoNT/A细胞检测方法的建立提供依据。方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcriptase chain reaction, qRT-PCR)对4种连续细胞中BoNTs毒性相关蛋白受体和N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, SNARE)进行定量检测,并用Western blot评估4种连续细胞和1种人神经元细胞对BoNT/A的敏感性。结果 qRT-PCR结果显示,4种连续细胞中除突触囊泡蛋白2B(synaptic vesicle protein 2B,SV2B)不表达或表达量较低外,其他BoNTs相关蛋白受体和SNARE蛋白均有较高的表达。Western blot结果显示,4种连续细胞对BoNT/A的敏感性依次为人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y5Y)、人神经母细胞瘤细胞[BE(2)-M17]。在SK-N-SH中,孵育0.1 mg/mL的三唾液神经节苷脂GT1b(Trisialoganglioside GT1b, GT1b),5 000 U/mL BoNT/A可切割45%突触小体相关蛋白25(synaptosome-associated protein of 25 000,SNAP25)。Western blot检测发现,1种人神经元细胞对BoNT/A较敏感,在约100 U/mL时达到50%的SNAP25裂解。结论 人神经元细胞敏感性优于其他4种连续细胞,在建立BoNT/A细胞学检测方法中具有一定的潜力。

A型肉毒毒素内肽酶免疫检测方法的建立

目的建立一种A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。方法首先构建参考底物蛋白SNAP251-197质粒并表达纯化,合成检测目标8肽序列且于兔体内制备并纯化其抗体;96孔板包被底物蛋白,利用ELISA方法建立A型肉毒毒素生物活性定量检测体系,并对检测方法的检测限、重复性及精密度等因素进行评价。结果成功表达纯化了SNAP251-197底物蛋白,制备并纯化了8肽兔多抗,建立了BoNT/A ELISA检测体系。结论成功建立了一种简便、灵敏、快速、稳定、可靠的A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。

C型肉毒毒素的研究进展

C型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type C,BoNT/C)通常与引起动物的食源性肉毒中毒相关,目前尚未发现人类肉毒中毒的相关病例报道。BoNT/C进入神经元细胞可以裂解突触小体相关蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25000,SNAP-25)和突触融合蛋白(syntaxin)。现对BoNT/C的口服毒性及肠上皮细胞的黏膜免疫;神经节苷脂作为神经毒素进入神经元细胞的双受体转运结合机制,以及对BoNT/C应用于临床靶向治疗神经母细胞瘤的进展作一概述。