电针结合康复训练对脑卒中肢体痉挛大鼠突触结合蛋白Ⅰ表达的影响研究

目的观察康复训练结合电针治疗对脑卒中肢体痉挛大鼠神经功能、运动功能、肌张力及大鼠脑干、脊髓中突触结合蛋白Ⅰ(SytⅠ)表达的影响。方法将75只SD大鼠随机分为5组,模型组、康复组、电针组和综合组采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型,空白组不做任何处理。造模成功后分别采用康复训练、电针、康复训练结合电针三种不同的治疗方案,每天1次,连续治疗6 d。术后第1、3、9天,分别评估神经功能、运动功能和肌张力变化;治疗结束后处死大鼠,应用免疫组织化学法测定SytⅠ的表达。结果术后1天、各组间无明显差异,术后3 d,各组评分分值均有降低的趋势,但其差异无统计学意义。术后9 d,康复组、电针组和综合组于模型组比较,各项指标都有所改善,以综合组较为明显,组间比较有统计学意义。结论康复训练、电针、康复训练结合电针三种不同的治疗方案,均可改善脑卒中肢体痉挛大鼠的神经功能、运动功能、肌张力,并可上调脑干、脊髓颈膨大、腰膨大中SytⅠ的表达,而尤以康复训练结合电针治疗方案更优。

锝标突触结合蛋白Ⅰ C2A片段探测肺癌凋亡的实验研究

目的探讨锝标突触结合蛋白ⅠC2A片段（^99mTc-C2A）探测非小细胞肺癌（NSCLC）化疗后,肿瘤细胞凋亡的情况。方法采用2-IT修饰后配体交换法标记合成^99mTc-C2A。H460 NSCLC肿瘤裸鼠25只,以25 mg／kg紫杉醇化疗诱导,分成治疗前、化疗诱导后12、24、48、72 h共5组,^99mTc- C2A显像探测化疗前后各组肿瘤组织细胞凋亡,勾画感兴趣区,计算肿瘤与对侧正常组织放射性比值（T／NT）。显像结束后,即刻断颈处死,取出肿瘤及各脏器,测定每克组织百分注射剂量率（％ID／g）。瘤体分成两部分,一部分通过流式细胞术测定肿瘤组织活化半胱氨酸天冬蛋白水解酶（caspase-3）,另一部分通过光镜HE及TUNEL染色测定凋亡指数。结果^99mTc-C2A显像显示,治疗前肿瘤有少量放射性摄取,肿瘤摄取为（1．21±0．51）％ID／g;化疗诱导后肿瘤摄取（％ID／g）明显增加,12、24、48 h肿瘤摄取分别为2．82±0．90、3．13±0．48和3．52±1．18。治疗前肿瘤T／NT为1．48±0．23;12、24、48 hT／NT分别为1．79±0．34、2．23±0．33和2．78±0．34,各组之间差异均有统计学意义（P〈 0．05）。未化疗组活化caspase-3为2．33±0．63％;紫杉醇化疗后,大量caspase-3被激活,12、24、48 h分别为（10．03±2．15）％、（33．80±5．04）％和（57．80±11．29）％。光镜HE及TUNEL染色法显示,未化疗组有散在细胞发生凋亡,化疗诱导后12、24、48、72 h大批细胞发生凋亡,12、24、48 h每个高倍视野中的凋亡细胞数分别为（8．25±2．27）％、（34．43±4．73）％和（71．88±11．88）％。肿瘤摄取同活化caspase-3及凋亡细胞数有很好的相关性。结论^99mTc-C2A显像可早期探测实体肿瘤化疗后凋亡,并和活化caspase-3及凋亡指数呈直线相关。C2A有望成为探测细胞凋亡的分子探针,进而早期预测和评价肿瘤疗效。

神经突触结合蛋白Ⅰ-C2A区重组表达及其在心脏缺血-再灌注大鼠模型中的显像研究

目的 利用基因工程方法重组表达神经突触结合蛋白Ⅰ的C2A片段,探讨其在心肌细胞凋亡显像中的应用价值.方法 （1）将C2A基因连接到含有谷胱甘肽转移酶（GST）的重组原核表达载体pGEX-6P-1上,转化感受态细菌BL21,异内基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后纯化.（2）用异硫氰酸荧光素（FITC）标记纯化的蛋白,通过细胞结合实验鉴定蛋白质活性.（3）采用2-亚氨基噻吩方法,进行99TcmO-4标记C2A-GST融合蛋白,标记后的蛋白质用纸层析法测定其放化纯.（4）制备大鼠心肌缺血-再灌注模型,通过尾静脉注射99Tcm-C2A-GST,1 h后用SPECT仪进行显像 显像结束后,处死大鼠,取出心肌,用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色,分离缺血心肌和存活心肌,测质量及其放射性计数,比较缺血心肌与正常心肌每克组织百分注射剂量率（%ID/g）值之间差别.采用SPSS12.0软件行统计分析,数据间比较采用t检验.结果 （1）成功表达的C2A-GST蛋白,相对分子质量约为3.8×104.（2）荧光显微镜下观察FITC-C2A-GST具有结合凋亡细胞的功能.（3）标记后的99Tcm-C2A-GST放化纯为（98.90±0.43）%.（4）大鼠显像示缺血损伤心肌显影清晰,体外测定缺血心肌摄取99Tcm-C2A-GST为（2.41±0.32）%ID/g,对照组99Tcm-C2A-GST-N-羟基琥珀酰亚胺（C2A-GST-NHS）的摄取为（0.82±0.24）%ID/g,两者之间差别具有统计学意义（t=10.6,P＜0.01）.结论 通过基因工程方法重组神经突触膜蛋白Ⅰ的C2A区域,重组后其具有监测缺血-再灌注大鼠模型中的心肌凋亡的作用.

突触结合蛋白Ⅰ的C2A结构域的两种膜结合状态及Ca^(2+)引发的插膜

突触结合蛋白(synaptotagmin)I是神经细胞突触囊泡上的一个膜整合蛋白,C2A是它的具有重要功能的近膜胞质片段。近年来的研究表明,突触结合蛋白Ⅰ在Ca^(2+)引发的神经递质快速释放过程中起到Ca^(2+)感受器的作用,而C2A结构域与神经细胞的突触前膜的相互作用与其Ca^(2+)感受器的功能密切相关,但是其作用机制还不清楚。利用气/液单层膜技术结合表面密度的测量,发现C2A存在两种膜结合状态:无Ca^(2+)时,以静电作用力为主的表面吸附状态;有Ca^(2+)时,静电力起部分作用的插膜状态。两种状态时C2A都倾向于与带负电荷,如磷脂酰丝氨酸的磷脂膜结合。将C2A转染表达在PC12和HEK-293细胞中,利用免疫染色和Western blot检测也表明,C2A在有无Ca^(2+)存在的情况下都主要存在于膜附近。实验结果提示,突触结合蛋白Ⅰ作为Ca^(2+)感受器的可能分子机制:突触结合蛋白Ⅰ的C2A的表面吸附功能在囊泡锚定或活化时协助囊泡附着在活化区,当细胞内Ca^(2+)浓度迅速增加,C2A Ca^(2+)依赖的插入负电荷膜的特点可以将囊泡拉近突触前膜,加之同时和其他蛋白,如SNARE复合物的作用引发膜的融合。

醒脑静对七氟烷麻醉小鼠海马中突触结合蛋白-Ⅰ表达的影响与学习记忆相关性

目的:探讨醒脑静注射液(Xingnaojing,XNJ)预处理对七氟烷(sevoflurane)麻醉小鼠海马中突触结合蛋白-Ⅰ表达的影响及与学习记忆的相关性。方法:60只成年雄性C57BL/6小鼠经Morris水迷宫训练4d后,随机分为对照组、模型组、1ml/kg、5ml/kg和10ml/kg醒脑静组。采用3%七氟烷持续吸入6h建立七氟烷麻醉小鼠模型,给药组于麻醉前2h分别给予醒脑静1ml/kg、5ml/kg和10ml/kg腹腔注射,模型组于相同时间点给予生理盐水10ml/kg腹腔注射。麻醉结束12h后,应用Morris水迷宫测试小鼠的学习记忆能力,应用Realtime PCR分析突触结合蛋白-Ⅰ(synaptotagmin-Ⅰ,Syt-Ⅰ)mRNA的表达,应用免疫荧光法分析Syt-Ⅰ蛋白的表达情况,应用脑片LTP检测分析小鼠海马中的突触可塑性变化。结果:醒脑静预处理(10ml/kg)可明显改善小鼠的空间学习记忆能力,减少逃避潜伏期、增加穿越平台次数,提示醒脑静对七氟烷诱导的小鼠认知功能损伤有明显的改善作用。进一步的机制研究表明醒脑静预处理(10ml/kg)可增强小鼠海马组织中Syt-Ⅰ的蛋白和mRNA表达水平;同时,能明显提高兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)斜率相对值(%)。结论:醒脑静能够有效提高七氟烷麻醉后小鼠海马中Syt-Ⅰ的表达水平,调节突触可塑性,改善其学习记忆功能,且作用呈一定的剂量依赖性。

成年小鼠七氟醚麻醉手术后海马突触结合蛋白-Ⅰ表达的变化

目的 评价突触结合蛋白-Ⅰ（synaptotagmin-Ⅰ,syt-Ⅰ）在七氟醚麻醉的成年小鼠海马中的表达变化. 方法 成年雄性C57BL/6小鼠120只,16周龄,体重（21.2＆#177;2.2）g,采用随机数字表法分为4组（每组30只）：吸氧＋生理盐水＋戊巴比妥钠组（C组）、吸氧＋生理盐水＋腹腔探查术＋戊巴比妥钠组（S组）、七氟醚麻醉＋腹腔探查术＋生理盐水组（SS组）和七氟醚＋腹腔探查术＋地塞米松组（SD组）.麻醉前1h,SD组腹腔注射地塞米松（2 mg/kg）,余3组腹腔注射等量生理盐水.C组、S组1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,SS组、SD组3.4％～3.6％七氟醚麻醉,S组、SS组、SD组行腹腔探查术.麻醉手术结束24 h后,水迷宫训练后测定各组的潜伏期、穿越平台次数、目标象限游泳时间.水迷宫测试结束后2h进行条件恐惧训练,条件恐惧训练结束24 h后进行场景恐惧和条件恐惧测试.行为学测试结束后取小鼠海马组织,Western blot检测syt-Ⅰ、IL-1β、S100A8含量,RT-PCR检测S100A8、Toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）、IL-6、IL-1β、TNF-α,mRNA含量. 结果 与C组比较,S组和SS组第3、4、5天潜伏期延长、穿越平台次数减少、目标象限游泳时间缩短、场景恐惧时间下降（P均＜0.05）;与SS组比较,SD组潜伏期缩短、穿越平台次数增加、目标象限游泳时间增加、场景恐惧时间增加（P均＜0.05）.4组条件恐惧僵直反应差异无统计学意义（P＞0.05）.与C组比较：S组和SS组IL-1β和S100A8蛋白及其mRNA表达增加,TNF-α mRNA表达增加（P＜0.05）;SS组syt-Ⅰ及TLR4 mRNA含量降低,IL-1β和S100A8蛋白及其mRNA表达增加（P＜0.05）. 结论 syt-Ⅰ表达下降参与了七氟醚麻醉手术后成年小鼠认知功能障碍.

电针疗法联合康复运动训练治疗脑卒中肢体痉挛大鼠的机制

目的探讨电针联合康复运动对脑卒中模型大鼠肢体痉挛的治疗机制。方法取60只SD大鼠,将造模成功者随机分为电针+康复运动组、电针组、康复运动组及正常组和模型组每组10只。建模成功后第3天开始治疗,康复运动组治疗1次/d,30 min/次;电针组治疗1次/d,30 min/次;电针+康复运动组治疗时先进行康复训练治疗,再进行电针治疗,治疗方法及时间与单独治疗组相同三组均连续治疗1 w。分别于术后1、3、10 d对各组大鼠进行神经功能评定,治疗前后测定肌张力实验结束时,取各组大鼠脊髓颈膨大、腰膨大和脑干,测定大鼠突触结合蛋白Ⅰ表达水平。结果电针+康复运动组治疗后大鼠神经功能分数降低最显著,与单独治疗比较差异有统计学意义(P<0.05)。与电针组和康复运动组相比,电针+康复运动组改善模型大鼠肌张力效果更明显(P<0.05),各组织中的突触结合蛋白Ⅰ表达增多最明显(P<0.05)。结论电针联合康复运动训练治疗对模型大鼠脊髓颈膨大组织、脑干组织及腰膨大组织中的突触结合蛋白Ⅰ表达具有明显的促进作用,这可能是联合疗法改善脑卒中大鼠肢体痉挛神经功能及肌肉功能更优的内在机制之一。

放射性核素凋亡显像检测细胞凋亡研究进展

放射性核素细胞凋亡显像具有直观、无创伤和实时在体观察细胞凋亡等特点,在脑及心肌细胞缺血再灌注损伤的观察、器官移植后排斥反应的检测、肿瘤放疗和化疗效果的评估和多巴胺能神经元早期凋亡的检测等方面具有较好的应用前景,但仍有许多问题有待于进一步探讨。

核素细胞凋亡显像剂的研究进展

放射性核素细胞凋亡显像具有直观、无创伤和实时在体观察细胞凋亡等特点,在脑及心肌细胞缺血再灌注损伤的观察、器官移植后排斥反应的检测、肿瘤放疗和化疗效果的评估等方面具有较好应用前景。本文主要根据临床前期的研究对放射性核素凋亡显像剂的设计、作用机制及应用进行介绍。

甲状腺激素对成年大鼠额叶内synaptotagmin 1表达的影响

目的研究不同甲状腺激素水平对SD大鼠额叶内突触结合蛋白1(syt1)表达的影响。方法用丙基硫氧嘧啶(PTU)复制成年期大鼠甲状腺功能减退(甲减)模型,左旋甲状腺素复制甲状腺功能亢进(甲亢)模型,放射免疫法测定血清甲状腺激素T3、T4水平,免疫组化SP法分析甲减组、甲亢组及正常对照组大鼠额叶分子层(Ⅰ层)、外颗粒层(Ⅱ层)、外锥体细胞层(Ⅲ层)、内颗粒层(Ⅳ层)和内锥体细胞层(Ⅴ层)syt1蛋白的表达情况。结果甲减组大鼠血清T3、T4显著低于正常对照组(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层syt1免疫反应产物明显少于正常对照组(P<0.05);甲亢组大鼠血清T3、T4显著高于对照组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ层syt1免疫反应产物也比正常对照组减少(P<0.05),仅在第Ⅳ层与正常对照组比较无统计学意义。结论甲状腺激素水平的降低和增高可导致成年期大鼠额叶内syt1蛋白表达减少,其减少的原因可能是不同的。