基于立即早期蛋白IE62建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法

目的:基于水痘-带状疱疹病毒(VZV)立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术(ELISpot)建立一种新型的VZV感染性滴度的快速检测方法。方法:应用生物信息学方法设计并合成VZV-IE62蛋白的多肽抗原,牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,筛选和制备抗VZV-IE62单克隆抗体,应用Western blot和免疫荧光法等开展抗体性能评价,继而应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大法建立新型的VZV感染性滴度检测方法,并与经典空斑计数法进行比较。结果:获得抗VZV-IE62的单克隆抗体1B7,应用于ELISpot方法可特异识别VZV感染后的细胞,以之为基础建立了新型的VZV感染性滴度检测方法。相比经典空斑计数法,该方法可显著缩短检测时间(从5至7 d缩短至32 h)检测结果具有较好的一致性。结论:本研究建立了一种新型的基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法(VZV-IE62 ELISpot),具有潜在的转化应用前景,可为VZV的防治研究提供支持。

自噬对水痘-带状疱疹病毒感染豚鼠背根神经节模型中病毒结构及功能蛋白表达的影响

目的探讨自噬诱导剂雷帕霉素及抑制剂3-甲基腺嘌呤对水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染豚鼠背根神经节模型中病毒结构及功能蛋白生物合成的影响及机制。方法在人胚肺成纤维细胞(HELF)中培养扩增VZV,同时分离提取豚鼠外周血单个核细胞(PBMC),VZV-HELF与PBMC共培养18~20 h,离心收集VZV-PBMC。32只豚鼠随机平均分为4组,每组8只:空白对照组于内眦静脉丛注射自体PBMC;自噬抑制组、自噬诱导组、VZV感染组分别先腹腔注射3 mg/kg 3-甲基腺嘌呤溶液、0.5 mg/kg雷帕霉素溶液、相同体积的0.9%NaCl溶液,2 h后均于内眦静脉丛注射VZV-PBMC 50μl。14 d后,处死各组豚鼠,取背根神经节组织,透射电镜观察病毒颗粒形态及自噬囊泡形态及数目,Western印迹检测VZV核衣壳蛋白(NCP)和立即早期蛋白62(IE62)及自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达,免疫组化检测VZV感染的背根神经节中抗VZV抗体的表达。统计分析采用两独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验或Kruskal-Wallis H检验。结果透射电镜下,VZV感染组背根神经节中可见核衣壳病毒粒子及散在的自噬体结构。空白对照组、VZV感染组、自噬诱导组及自噬抑制组自噬囊泡数量[M(Q1,Q3)]分别为0、5(4,6)、7(5,9)、0个,差异有统计学意义(H=135.60,P<0.01),VZV感染组显著高于空白对照组及自噬抑制组(均P<0.05),但与自噬诱导组差异无统计学意义(P>0.05),而自噬诱导组显著高于自噬抑制组(P<0.05)。Western印迹显示,VZV感染组IE62蛋白表达水平(1.49±0.06)显著高于空白对照组(0.50±0.09),t=9.17,P<0.05;自噬抑制组抗VZV抗体表达显著低于自噬诱导组和VZV感染组(t值分别为9.24、7.78,均P<0.01),而自噬诱导组与VZV感染组抗VZV抗体表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论VZV感染豚鼠背根神经节后发生了自噬;通过抑制自噬,豚鼠背根神经节中部分VZV结构及功能蛋白的表达水平下降。