磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用

建立了一种基于磁性荧光免疫纳米探针的竞争性免疫分析法并用于检测人免疫球蛋白G(IgG),蛋白G被用作抗体与磁性纳米团簇定向结合的衔接蛋白.将蛋白质修饰的磁性纳米团簇与荧光猝灭剂(DABCYL)标记的山羊抗人IgG偶联,然后与羧基荧光素(FAM)标记的人IgG孵育,得到磁性荧光纳米复合免疫探针,最后与目标分析物(人IgG)孵育,进行竞争性免疫反应.结果表明,抗体的定向连接可以有效避免其抗原活性位点被包覆,而小尺寸的纳米团簇可以起到信号放大作用,从而提高检测灵敏度.该探针检测IgG的线性范围为0.06~146.00nmol·L^(-1),检测限为0.02nmol·L^(-1)(S/N=3),其抗干扰能力强,并且能够用于人血清中Ig G的检测.

直接竞争化学发光酶免疫法检测氟喹诺酮类药物方法的建立

建立一种能够快速检测动物源性食品中多种氟喹诺酮类药物残留的直接竞争化学发光酶免疫法。用诺氟沙星(NOR)分子修饰后制备的完全抗原免疫小鼠,获得对10种氟喹诺酮类药物具有广谱特异性的单克隆抗体,采用二因子交叉试验确定包被原与酶标抗体的最佳稀释度,通过单因素试验优化最佳包被条件、封闭液种类、竞争反应时间,从而建立反应过程的最佳条件,并对方法的灵敏度、交叉反应率、精密度进行评价。结果表明:NOR-1-OVA包被浓度0.3μg/mL,酶标抗体的稀释倍数为1∶8000时为最佳稀释浓度;4℃包被过夜,封闭液为1%BSA,竞争时间为1 h时为最优反应条件。对10种氟喹诺酮类药物的灵敏度(IC50)为1.46~11.57 ng/mL,交叉反应率为12.6%~118.9%,并且与其他非喹诺酮类药物无交叉反应率;检出限为0.07~0.27 ng/mL,且批内差异和批间差异均低于10%;加标回收率为73.3%~103.1%,变异系数为1.9%~11.8%。以上结果表明,该方法可作为动物源性食品中10种FQs残留检测的常规方法。

竞争免疫荧光分析法高灵敏、高选择性检测赭曲霉毒素

基于半抗原与二抗竞争结合固相抗体的免疫模式,建立了一种高灵敏、高选择性检测赭曲霉毒素的新型免疫荧光分析法.赭曲霉毒素具有半抗原性,可与基底抗体作用.当赭曲霉毒素加入到该体系后,与异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔(IgG-FITC)发生竞争反应,随着赭曲霉毒素浓度的增加,IgG-FITC与抗体结合的浓度减少,荧光强度降低.在最佳实验条件下,荧光强度的变化值(ΔF])与赭曲霉毒素浓度的对数在1nmol/L-100μmol/L范围内呈良好的线性关系,相关系数R=0.9932.方法的检出限为0.35nmol/L.将该方法用于不同种类的酒样中赭曲霉毒素的测定,结果令人满意.与传统方法相比,本方法是一种低成本、高灵敏度、高选择性的检测方法,在食品安全领域中具有潜在的应用价值.

基于巯基自组装单层膜的植物生长激素吲哚乙酸电化学免疫传感器的研究

提出了一种酶标识抗原与待测样品的竞争免疫反应定量测定IAA的方法 .该方法是基于金基底上形成了均一、稳定、有序的巯基自组装单层膜 ,能以共价方式固定抗体 .利用循环伏安法探讨了底物在不同条件下的反应特征 ,并研究了最佳实验条件 .在浓度 5 68× 10 -7～ 2 83× 10 -5mol/L范围内、-2 0 0mV电位下 ,响应电流与lg[IAA]呈线性关系 ,其回归方程 :i(nA) =-2 0 83 3 3×lg( 10 6[IAA] ) +68 9167,相关系数 0 9915 .对样品IAA的总含量进行测定 。

葡萄球菌A型肠毒素检测竞争ELISA方法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法,应用构建的pGEX-6P-SEA、pET28α-SEA重组质粒表达带有不同融合肽的葡萄球菌A型肠毒素,分别通过谷胱甘肽亲和纯化、镍螯合纯化获得SEA的重组融合表达蛋白HIS-SEA、GST-SEA,以HIS-SEA为包被抗原,以GST-SEA、天然SEA肠毒素为竞争抗原,确立了SEA型肠毒素ELISA检测的工作条件:包被浓度为2.5μg/mL,阳性血清稀释度为1∶50,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白工作浓度为1∶2000。建立了以重组肠毒素GST-SEA作为竞争抗原检测葡萄球菌肠毒素SEA的间接竞争ELISA(ciELISA)方法,竞争肠毒素GST-SEA蛋白浓度x与P/N值y的关系式:x(GST-SEA)=1.99-y/0.34,R2(GST-SEA)=0.9964,线性检测范围均为1～62.5ng/mL,最低检测量为1ng/mL,此方法丰富了食品中A型肠毒素的检测手段。

TBa多克隆抗体的制备及其重组蛋白免疫活性的鉴定

目的:TBa(tartary buckwheat allergen)是苦荞麦中的主要过敏原。为了研究TBa的结构与功能关系并鉴定其重组蛋白的特异性免疫活性。方法:采用之前从种子中分离纯化的天然TBa作为抗原免疫小鼠,制备抗血清,建立了类似竞争酶联免疫吸附检测TBa的分析方法。结果:对重组TBa的免疫活性鉴定表明,采用该方法制备的多克隆抗体能满足重组TBa的免疫活性鉴定,这为下一步研究其免疫学功能奠定了基础。

应用酶联免疫技术检测动物源性食品中四环素类抗生素残留的研究

测定的基础是竞争性酶联免疫反应。四环素标准品或样品中游离的四环素与微孔板中的固相四环素 (包被结合到蛋白上的四环素 )竞争数量有限的四环素抗体 ,洗去没有连接的四环素抗体 ,加入酶标记物 ,酶标记物与四环素抗体结合的数量反比于游离的四环素的数量 ,以TMB -H2 O2 为底物 ,测量 4 5 0nm波长的吸光值 ,按标准曲线计算样品中四环素的含量。此方法测定下线为 15 0ng/kg。实验证明特异性、精密度及添加回收率符合目前国际上四环素类抗生素残留量检测的要求。

无色孔雀石绿单克隆抗体的制备与鉴定

用人工合成的无色孔雀石绿—牛血清白蛋白(LMG-BSA)作为抗原免疫BALB/c小鼠,并利用杂交瘤技术建立了1株稳定分泌无色孔雀石绿(LMG)单克隆抗体的杂交瘤细胞2E6。经鉴定表明,杂交瘤细胞染色体数为(99.12±3.60),间接竞争ELISA(ciELISA)显示LMG50%抑制质量浓度为20.39μg/L,诱生小鼠腹水的抗体效价达2.3×105。与水产养殖中常见的禁用激素和抗菌药物的交叉反应小,表明该单抗具有较好的敏感性和特异性。

基于银沉积的微间隙阵列电极检测盐酸克伦特罗的方法研究

本文旨在建立一种基于酶催化银沉积的微间隙阵列电极的盐酸克伦特罗检测方法,采用微间隙阵列电极作为基础电极,将竞争性酶联免疫反应与酶催化银沉淀信号放大技术相结合,建立了低浓度盐酸克伦特罗检测的微间隙阵列电极分析方法。该方法通过共价固定BSA结合抗原,经过竞争性免疫反应,捕获碱性磷酸酶结合抗体并催化银沉积。结果显示,盐酸克伦特罗浓度与电导率呈负相关。当盐酸克伦特罗浓度在100μg/L~100 pg/L范围内时,盐酸克伦特罗浓度的对数值与检测电导率之间呈良好的线性关系,线性相关系数为0.9978,检出限为100 pg/L,猪肉加标样品回收率在80%以上。故该方法具有灵敏度高、响应快、成本低、操作方便等优点,为盐酸克伦特罗等小分子的快速检测提供了一种有效手段。