SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测4种食源性致病弧菌

目的建立和优化4种食源性致病弧菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)快速检测方法。方法基于副溶血性弧菌的toxR基因(GenBank ID:MH047287.1)、霍乱弧菌的ompW基因(GenBank ID:MF100046.1)、拟态弧菌的toxR基因(GenBank ID:EF693743)和创伤弧菌的vvhA基因(GenBank ID:KC821520.1)设计常规PCR引物和qPCR特异性引物和探针。分别建立副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌4种食源性致病弧菌的单重qPCR检测体系,根据扩增曲线和Ct值对探针浓度进行优化,设置探针浓度梯度。结果4种弧菌的探针最适浓度均为0.1µmol/L。对设计的4种弧菌的引物分别进行常规PCR的扩增,其最低检出限均为1×10^(5) copies/µL,4种弧菌分别进行单重qPCR的最低检出限均为1×10^(1) copies/µL,扩增效率均接近100%。qPCR的灵敏度均高于常规PCR。特异性实验结果表明,4种目的弧菌DNA扩增出特异性曲线,其他的非目的基因未被扩增出扩增曲线。结论该方法准确度和灵敏度高,前处理简单快速,适用于4种食源性致病弧菌的荧光定量PCR快速检测。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

定量荧光聚合酶链式反应在流产组织染色体畸变分析中的诊断价值

目的评估在以拷贝数变异测序(CNV-seq)为主要遗传学检测手段对流产组织进行染色体畸变分析中辅以定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)检测的诊断价值。方法采用QF-PCR及CNV-seq技术同时检测2021年9月至2022年11月海口市妇幼保健院收集的110例流产组织样本。此外,QF-PCR技术将额外检测50例健康人群外周血样本进行数据补充。QF-PCR体系为自建体系,在13、18、21、性染色体共选择17个位点并将其分为两组。Panel A组由D13S796、D13S256、D18S386、D18S535、D21S11、D21S1446、DXS6809、HPRT构成;Panel B组由D13S371、D13S634、D18S51、D18S535、D18S819、D21S1409、D21S1412、DYS218、DXS981、AMEL构成。分析QF-PCR在判别13、18、21、性染色体非整倍体时与CNV-seq结论一致性、QF-PCR为CNV-seq进行母源污染鉴定能力,以及QF-PCR进行13、18、21、性染色体非整倍体的分型能力。结果对110例流产组织进行检测,两种方法结论一致例数占比为93.6%。其中QF-PCR避免了5例CNV-seq自身局限性造成的不准确结论,2例为QF-PCR的检测失败。在母源细胞污染鉴定能力上,15个短串联重复序列的观察杂合度、期望杂合度与个体识别能力值范围分别为0.737~0.950、0.593~0.941、0.817~0.975;D13、D18、D21与DX的累积He依次为0.9999、0.9998、0.9998与0.9985,累积个体识别能力大于0.999999999999999999999999999999;自建的QF-PCR方法在分型能力上表现良好,其干扰因素影响较小。结论QF-PCR联合CNV-seq检测可能成为未来孕早期流产组织遗传学分析的主要方法。它不仅能够降低CNV-seq的误诊率、鉴别母体细胞污染。采用自建QF-PCR体系还能够显著降低联合检测成本。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.

竞争性聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA

定量检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的现有方法主要是分子杂交法，敏感性为０．１～１ｐｇ，不能达到病毒最低感染水平。聚合酶链反应技术有极高的特异性，灵敏度可达１ｆｇ，相当于３×１０２个病毒颗粒。定量ＰＣＲ技术为研究病毒与疾病关系提供了强有力的手段。本文应用竞争性ＰＣ...

竞争性定量聚合酶链反应检测幽门螺杆菌cagA基因

目的 建立竞争性聚合酶链反应 (PCR)定量检测幽门螺杆菌 (Hp)细胞毒素相关蛋白基因A(cagA)的方法。方法 以重组PCR将乳糖操纵子中乳糖调节蛋白 (LacI)的特异性结合序列 (2 1bp)插入cagA基因的一段序列 (40 0bp)中得到重组cagA基因片段 (rfcagA)。体外克隆并表达谷胱甘肽转硫酶 LacI(GST LacI)的融合蛋白 ,其一端具有GST活性 ,另一端可特异性地与rfcagA结合。在定量PCR中 ,以rfcagA为内参标模板 ,pMC3或Hp基因组cagA作为竞争性模板 ,PCR产物的 5′ 端标记了生物素 ,可与包被了亲和素的微孔板结合。只有rfcagA的PCR产物可与融合蛋白结合而显色。结果 GST底物的显色程度与样本的cagA含量呈负相关 ,当反应体系中的起始模板量为 10～ 10 5拷贝 ,循环次数小于或等于 2 0次 ,原始模板数以指数方式增长 ,并建立了原始模板的对数与A3 40 值间的标准曲线。用该方法检测 14份已知菌液中的cagA ,9份阳性 ,5份阴性 ,符合实际情况 ;cagA的拷贝数为 6 3× 10 10 ～ 2 14× 10 11/L。结论 这是一项特异、敏感及实用的定量检测cagA基因的技术。

人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法 ,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系 ,我们抽取 2 6例健康儿童外周静脉血 ,分离血单核细胞 ,抽提RNA ,采用逆转录—聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达 ,并以正常人cDNA作定量标准物 ,待测样品与定量标准物共扩增 ,计算出待测样本的个体的mRNA量。研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达 ,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为 0 .37± 0 .15mol/molmRNA。表明采用竞争性逆转录—聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠 ,且能准确定量 ,值得推广应用。

竞争性聚合酶链反应定量检测血清HBV－DNA

竞争性聚合酶链反应定量检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍｈｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＤＮＡｂｙｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ刘重阳，周子成，杨建民，罗元辉，鲁荣，房殿春（第三军医大学附...

聚合酶链反应方法检测阴道毛滴虫准确性的meta分析

目的系统评价聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的应用价值。方法检索中国知网数据库(CNKI)、万方数据知识服务平台、维普数据库和PubMed数据库自建库到2023年5月30日以来基于PCR方法检测阴道毛滴虫的研究文献。经文献筛选、数据提取后,使用软件RevMan 5.4.1和网页服务Meta-Disc 2.0进行Meta分析。结果共纳入36篇文献,16454个临床样本。Meta分析结果显示:聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的合并敏感度为0.972(0.943,0.987),合并特异度为0.979(0.968,0.986),诊断比值比为1643.398(673.168,4012.008),阳性似然比为46.209(30.549,69.897)和阴性似然比为0.028(0.013,0.059);亚组分析表明不同性别的临床样本不会影响聚合酶链反应的检测准确性,但不同的PCR检测方法的准确性有差异。结论聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的准确性较高,具有良好的应用价值。

竞争性聚合酶链反应定量检测HBV DNA及对干扰素治疗的初步评价

目的：研究HBVDNA浓度与临床疾病关系及对干扰素治疗效果进行评价。方法：应用竞争性聚合酶链反应技术检测42例慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者血清HBVDNA含量，并对26例患者进行了人白细胞干扰素治疗前后循环血中HBVDNA浓度的动态观察。结果:慢乙肝患者血清HBVDNA含量在5×100～5×108拷贝μl之间；血清HBVDNA含量与ALT活性相关关系不明显（r=0.2862，P＞0．05）；干扰素治疗前完全反应组HBVDNA浓度显著低于部分反应组（t=4.84，P＜0.01）和无反应组（t=6．26，P＜0．01）。结论：HBV感染后产生的各种临床疾病类型可能主要归于宿生免疫应答的不同，HBVDNA浓度较低的患者（小于10000拷贝／μl）干扰素治疗效果较好，定量检测HBVDNA浓度在抗病毒药物疗效预测和评价中是一个有重要意义的参考指标。

竞争性逆转录-聚合酶链反应对哮喘患者诱导痰白细胞介素-10基因表达的定量分析

目的:建立竞争性逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)定量方法,监测哮喘患者白细胞介素-10(IL-10)基因的表达水平,探讨IL-10在哮喘气道炎症中的作用和临床意义。方法:用酶切法构建IL-10内标分子,用已知量的该内标分子,通过竞争性RT-PCR对哮喘组(30例)和对照组(29例)的诱导痰和外周血IL-10 mRNA进行定量分析。结果:哮喘发作期患者的诱导痰和外周血绝大多数未检测到IL-10 mRNA,部分缓解期患者有少量IL-10 mRNA表达。健康对照者外周血和诱导痰均有IL-10 mRNA表达。结论:哮喘患者的气道炎症过程与IL-10基因表达有关,且存在IL-10转录水平的合成障碍。

竞争性反转录聚合酶链反应对髌韧带中的α_1-Ⅰ型胶原蛋白基因表达的定量检测

应用竞争性反转录聚合酶链反应技术,对韧带中的α_1-Ⅰ型胶原蛋白基因表达进行了定量测定。研究表明:该技术是适用于对一小块髂韧带中的基因表达进行定量研究。

多重实时聚合酶链式反应法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立多重实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichiacoli,STEC)的方法。方法以产志贺毒素大肠埃希氏菌携带的毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae靶基因引物探针建立多重实时PCR体系,并采用原位冻干技术将PCR反应体系和阳性质控品进行了预先分装冻干,制成稳定、便捷的即用型反应体系,随后对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果所建立的多重实时PCR法检测eae、stx1、stx2基因的灵敏性为102 CFU/mL。与32种非STEC菌均无交叉反应。整体检测时长可控制在1 h以内,冻干体系可在常温条件下保存1年以上。结论本方法快速、简便,适用于测定食品中的STEC。

数字聚合酶链反应技术对甲状腺结节术前良恶性的鉴别诊断价值

目的探讨数字聚合酶链反应(dPCR)技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。方法收集2019年6月至2022年9月在该院进行超声引导下细针穿刺细胞学检查(FNAC)且接受手术治疗的甲状腺结节患者穿刺液标本141份,采用dPCR和扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR检测BRAF V600E基因突变,dPCR同时检测NRAS Q61R基因突变、TERT基因启动子C228T和C250T突变。以患者术后病理检测结果为金标准,比较几种方法的准确率,评价dPCR技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。结果141份穿刺液标本中,dPCR对BRAF V600E的检出率为69.50%(98/141),ARMS-PCR对BRAF V600E的检出率为64.54%(91/141),差异有统计学意义(P<0.05);dPCR检测NRAS Q61R、TERT C228T、TERT C250T在甲状腺乳头状癌(PTC)中的突变检出率分别为15.32%(17/111)、12.61%(14/111)和1.80%(2/111)。单独使用dPCR检测BRAF V600E鉴别诊断甲状腺结节良恶性的准确率为89.36%,明显高于ARMS-PCR(84.40%)和FNAC(77.30%),差异均有统计学意义(P<0.05)。dPCR(BRAF V600E)+FNAC的诊断准确率为97.16%,dPCR多基因[BRAF V600E+NRAS Q61R+TERT(C228T+C250T)]+FNAC的诊断准确率为97.87%,均高于单独dPCR(BRAF V600E)、dPCR(多基因)的诊断准确率,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论dPCR可检测出ARMS-PCR漏检的基因突变位点,也可以弥补FNAC的不足,该技术联合FNAC可提高甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断的效能。