竞争性特异等位基因PCR检测山东甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯的抗性

为明确山东地区甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯抗性水平,采用竞争性特异等位基因PCR方法,检测甜菜夜蛾钠离子通道基因片段上L1014F的突变频率。结果表明,敏感种群个体中均未发现突变个体;田间章丘种群92%个体具有L1014F突变,其中64%为L1014F突变纯合子,28%为L1014F突变杂合子。经高效氯氰菊酯汰选5代后的抗性种群检测个体中均未发现敏感型纯合子。安丘种群的L1014F突变等位基因频率最高,为85%,泰安、滕州和滨州种群分别为50%、43.33%和30%,相关性分析表明甜菜夜蛾L1014F突变等位基因频率与对高效氯氰菊酯不敏感度呈线性正相关(Y=1.106x+0.079,R2=0.93)。

基于竞争性等位基因特异性PCR技术的麦芽品种纯度定性和定量检测

利用测序技术筛选和确认4个可以区分7种大麦麦芽的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,并建立区分图谱。同时,利用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应检测技术对预混样品进行定量测试,其检测的结果与真实性之间相对误差小于3%。该技术的建立对大麦麦芽纯度检测提供方法,对大麦麦芽SNP指纹数据库的完善提供了数据支持。

竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应法和DNA直接测序法检测KRAS G12D突变的对比分析

目的对比分析竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应(castPCR)法和DNA直接测序法检测肠镜活组织检查标本KRAS G12D突变的差异。方法应用活组织检查钳收集肠镜下结直肠腺瘤和结直肠癌组织,抽提组织DNA,分别采用castPCR法和DNA直接测序法获得KRAS G12D的突变情况。结果腺瘤组和腺癌组castPCR法检测的KRAS G12D突变率均显著高于同组DNA直接测序法(P值均<0.05),两组间castPCR法和DNA直接测序法检测的KRAS G12D突变率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。腺瘤组两种检测方法的突变型符合率为55.6%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为87.5%,一致性检验Kappa值为0.643 5;腺癌组两种检测方法的突变型符合率为50.0%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为85.0%,一致性检验Kappa值为0.583 3。提示两种方法检测阴性的一致性程度均较高,但检测阳性的一致性程度一般。Mutation Detector分析结果显示,castPCR法能够检测出突变量<1%的突变,灵敏度高达0.1%。检测突变量分析结果显示,当KRAS G12D突变量≥4%时,castPCR法和DNA直接测序法检测KRAS G12D均为阳性;当突变量<4%时,仅castPCR法能够检测出KRAS G12D为阳性。提示castPCR法能够检测出DNA直接测序法检测不出的KRAS G12D突变,较DNA直接测序法效率高。结论 castPCR法能够高效地检测肠镜活组织检查标本中低突变量的KRAS G12D,其临床实用价值较DNA直接测序法高。

恒河猴和食蟹猴ABO血型竞争性等位基因PCR(KASP)检测方法的建立

目的人的ABO血型常规免疫学检测方法不适用于实验猴猕猴血型检测,而实验猴血型鉴定在器官移植等研究中必不可少。本研究目的是建立一个快速、可靠的恒河猴与食蟹猴ABO血型核酸鉴定方法。方法本室建立了一种新的ABO血型的分子学检测方法,利用竞争性等位基因PCR(KASP)技术,通过识别与血型密切相关功能基因的2个SNP位点上的碱基,对恒河猴与食蟹猴血型进行分型,并通过设计2个SNP位点外围的普通PCR引物,对KASP方法鉴定出的血型样本进行Sanger测序鉴定。结果比对了15份用TaqmanPCR方法已确定血型的食蟹猴全血核酸样本,新建立的KASP分型结果与原血型结果完全一致,为了保证KASP方法鉴定结果的准确性,实验人员用新建立的普通PCR方法通过Sanger测序验证了KASP方法与测序结果完全一致。为了对新建的KASP方法重复性进行验证,选取了已知血型的6份实验猴全血,每份血样做5个重复,结果显示该方法有极好的重复性。进一步用新建的KASP方法检测了51份临床样本,其中食蟹猴样本38份,恒河猴样本13份,同一样本的2个位点的血型结果完全一致,其中A型血9份(17.6%),B型血19份(37.3%),AB型血23份(45.1%),未检出O型血。同时从A型、B型、AB型的临床样本中,各型分别选了5个样本,进行普通PCR扩增及测序分析,证明2个SNP位点上的序列与KASP分型结果一致。结论新建的KASP血型鉴定方法准确性高,可用于实验恒河猴与食蟹猴的ABO血型的快速检测。该方法相较于传统的血清学或测序方法,简单快捷,经济可靠,结果易于判读,同时对样本的要求比传统的血清学方法低,新鲜或存放较久的全血、唾液或核酸等都可以用于检测。

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的:查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法:查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果:当退火温度为66℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论:多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

用等位基因特异PCR检测普通小麦(Triticum aestivum L.)的单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系(RIL)的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料,研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列,在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,对SNP进行分型,同时研究了特异引物3′端碱基错配对等位基因特异PCR的影响,优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3′端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大;在等位基因特异PCR中,Mg2+、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3′端加上合适的错配碱基,并且优化其PCR反应体系,用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。

利用等位基因特异PCR鉴别虎掌南星及其部分混淆品

目的:建立中药材虎掌南星的分子鉴定方法,为天南星药材质量控制提供依据。方法:GenBank中下载半夏属、天南星属、犁头尖属物种的叶绿体rpl20基因序列,利用DNAMAN进行比对分析,发现半夏属和虎掌南星的SNP位点,并设计鉴别引物Ptrpl94F,Ptrpl708R和Pprpl148F,Pprpl484R,采用等位基因特异PCR方法对虎掌南星、半夏、水半夏3个物种的10个样品进行扩增。结果:引物Pprpl148F和Pprpl484R仅对虎掌南星扩增333 bp条带,半夏、水半夏均无扩增,能准确鉴别虎掌南星。引物Ptrpl94F和Ptrpl708R对半夏、虎掌南星均扩增611 bp条带,水半夏无扩增。结论:本实验建立的等位基因特异PCR方法能准确区别出虎掌南星和半夏、水半夏,为虎掌南星及半夏的正确用药提供了保障。

等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型

目的了解人群CYP2C19基因型的分布,评价等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型。方法等位基因特异荧光PCR法和金标准Sanger DNA直接测序法检测356名供者外周血CYP2C19基因型,实验采用同步盲法。结果 CYP2C19*1/*1型、CYP2C19*1/*2型、CYP2C19*2/*3型、CYP2C19*3/*3型、CYP2C19*2/*2型及CYP2C19*1/*3型的频率分布:使用PCR荧光法检测时分别为46.6%(166/356)、33.2%(118/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、10.7%(38/356)及6.7%(24/356);采用DNA测序法时分别为46.3%(165/356)、33.4%(119/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、11.0%(39/356)及6.5%(23/356)。两种方法检测CYP2C19基因型具有一致性(P=0.392),且一致性较好(Kappa=0.987);两种方法基因型检测结果一致率为99.2%。结论为保障医疗安全,临床需开展CYP2C19基因型检测;等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型简便可靠。

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×104CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。

等位基因特异PCR检测N-乙酰化转移酶遗传多态性研究

目的与方法 :改良一种适用于流行病学研究的N 乙酰化转移酶 (NAT2 )基因型的等位基因特异PCR(AS PCR)检测方法 ,分析了 3个NAT2基因突变点 :481T、5 90A、85 7A ,并用此法对 76例南京地区健康人群的NAT2基因型多态性进行了研究。从而也检验了该方法。结果 :该人群中各基因频率 :Wt(野生型 )为 0 .5 72 3:481T为 0 .0 395 ;5 90A为 0 .2 36 8;85 7A为 0 .15 13。与白种人比较差异有显著性 ,而与文献报道的亚州人群频率分布特征基本一致。结论 :南京地区健康人群中与快反应相关的NAT2基因型占多数 (82 .9% ) ;本文改良的AS PCR检测方法经验证为NAT2基因多态性研究的有效实验手段。

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。

等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究

了解北京地区异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌(MTB)的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值。选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR-RFLP和反向线性杂交技术(RLB)检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60.3%(35/58)存在katG315突变,13.8%(8/58)发生了inhA突变,两者同时突变率为6.9%(4/58),INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18.2%(8/44)。上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB。北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率。等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段。

双向等位基因特异性PCR技术在杏SNP分型上的应用

【目的】建立一种基于单碱基突变的双向等位基因特异PCR(bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)技术,并将其应用于杏单核苷酸多态性分型研究。【方法】利用直接测序的方法在2份不同果肉质地杏EXP基因的DNA序列上发现1个单碱基变异。在其上、下游两端设计双向等位基因特异性引物及其外侧互补引物,对120份杏材料的SNP进行分型。同时,对部分材料的基因型进行测序验证。【结果】利用双向等位基因特异PCR对杏EXP基因315 bp处SNP分型结果与直接测序完全一致。【结论】双向等位基因特异PCR技术是一种简单、经济、快速而可靠的SNP分型方法,可有效地应用于杏基因组上已知SNP突变的分型研究。

CYP17基因多态性等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的建立快速准确检测CYP17基因单核苷酸多态性的新方法。方法用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法对53例外周血标本CYP17基因单核苷酸多态性位点rs743572进行基因分型。结果 AS-PCR测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(PCR-RFLP)的测定结果一致。结论采用AS-PCR检测CYP17基因多态性准确、快速。

等位基因特异PCR技术的研究与应用

生物的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)具有数量多、分布广、易于分型、稳定性强等优点,很适合于用做分子标记。等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)是根据SNP位点设计3′末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物,通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无,从而检测基因型中SNP的一种技术。经过不断地改进与完善,基于SNP的等位基因特异PCR标记已逐渐成为一种快速、简便、低成本、可靠、高通量的检测基因型SNP的方法。本文应用等位基因特异PCR技术,根据小麦TaDREB1基因在旱选10和鲁麦14的120(C→A)SNP成功地开发了一个SNP分子标记,证明了该方法的有效性和可行性。

一种检测细胞微量点突变的方法——等位基因特异的PCR

为了灵敏、方便地检测出细胞群体中含量极低的点突变 ,利用一 β珠蛋白基因簇Gγ 2 0 2C→G突变的杂合细胞株 ,优化传统的等位基因特异PCR的反应条件 ,以定量的PCR产物为模板 ,在含 5 %甲酰胺的体系中用半巢式的等位基因特异引物进行扩增 .结果表明 ,该方法灵敏可靠 ,可快速检测到细胞群体中低于 0 0 2 5

HLA-DQB1等位基因与汉族人系统性红斑狼疮易感性分析

使用聚合酶链反应(PCR)结合顺序特异的苷核苷酸(SSD)探针杂交方法分析HLA-DQB1等位基因与SLE的相关性。结果发现患者纽中DQB1*0601,DQB1*0602等位基因频率明显高于正常对照组,但校正P值后差异不显著。表明HLA-DQB1等位基因与汉族人SLE的关联不明显,而与DQ位点呈强连锁不平衡的DR位点或DR、DQ单倍型则可能与SLE的易感性密切相关。

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primerARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。

竞争性等位基因特异性PCR分型技术在植物抗病遗传育种中的应用

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)广泛分布在植物基因组中,位点丰富,易于实现高通量分析。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种对特定位点处的SNP以及插入和缺失(insertion-deletion,In Dels)进行双等位基因分型的技术,具有稳定性好、准确性高、无需合成特异荧光探针、检测成本较低和高通量等优点,近些年在医学和农学领域都有广泛的应用。本研究介绍了KASP技术的原理,综述了该技术在小麦等植物抗病遗传育种中的应用,并讨论了该技术的优缺点。