竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应法和DNA直接测序法检测KRAS G12D突变的对比分析

目的对比分析竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应(castPCR)法和DNA直接测序法检测肠镜活组织检查标本KRAS G12D突变的差异。方法应用活组织检查钳收集肠镜下结直肠腺瘤和结直肠癌组织,抽提组织DNA,分别采用castPCR法和DNA直接测序法获得KRAS G12D的突变情况。结果腺瘤组和腺癌组castPCR法检测的KRAS G12D突变率均显著高于同组DNA直接测序法(P值均<0.05),两组间castPCR法和DNA直接测序法检测的KRAS G12D突变率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。腺瘤组两种检测方法的突变型符合率为55.6%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为87.5%,一致性检验Kappa值为0.643 5;腺癌组两种检测方法的突变型符合率为50.0%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为85.0%,一致性检验Kappa值为0.583 3。提示两种方法检测阴性的一致性程度均较高,但检测阳性的一致性程度一般。Mutation Detector分析结果显示,castPCR法能够检测出突变量<1%的突变,灵敏度高达0.1%。检测突变量分析结果显示,当KRAS G12D突变量≥4%时,castPCR法和DNA直接测序法检测KRAS G12D均为阳性;当突变量<4%时,仅castPCR法能够检测出KRAS G12D为阳性。提示castPCR法能够检测出DNA直接测序法检测不出的KRAS G12D突变,较DNA直接测序法效率高。结论 castPCR法能够高效地检测肠镜活组织检查标本中低突变量的KRAS G12D,其临床实用价值较DNA直接测序法高。

基于竞争性等位基因特异性PCR技术的麦芽品种纯度定性和定量检测

利用测序技术筛选和确认4个可以区分7种大麦麦芽的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,并建立区分图谱。同时,利用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应检测技术对预混样品进行定量测试,其检测的结果与真实性之间相对误差小于3%。该技术的建立对大麦麦芽纯度检测提供方法,对大麦麦芽SNP指纹数据库的完善提供了数据支持。

恒河猴和食蟹猴ABO血型竞争性等位基因PCR(KASP)检测方法的建立

目的人的ABO血型常规免疫学检测方法不适用于实验猴猕猴血型检测,而实验猴血型鉴定在器官移植等研究中必不可少。本研究目的是建立一个快速、可靠的恒河猴与食蟹猴ABO血型核酸鉴定方法。方法本室建立了一种新的ABO血型的分子学检测方法,利用竞争性等位基因PCR(KASP)技术,通过识别与血型密切相关功能基因的2个SNP位点上的碱基,对恒河猴与食蟹猴血型进行分型,并通过设计2个SNP位点外围的普通PCR引物,对KASP方法鉴定出的血型样本进行Sanger测序鉴定。结果比对了15份用TaqmanPCR方法已确定血型的食蟹猴全血核酸样本,新建立的KASP分型结果与原血型结果完全一致,为了保证KASP方法鉴定结果的准确性,实验人员用新建立的普通PCR方法通过Sanger测序验证了KASP方法与测序结果完全一致。为了对新建的KASP方法重复性进行验证,选取了已知血型的6份实验猴全血,每份血样做5个重复,结果显示该方法有极好的重复性。进一步用新建的KASP方法检测了51份临床样本,其中食蟹猴样本38份,恒河猴样本13份,同一样本的2个位点的血型结果完全一致,其中A型血9份(17.6%),B型血19份(37.3%),AB型血23份(45.1%),未检出O型血。同时从A型、B型、AB型的临床样本中,各型分别选了5个样本,进行普通PCR扩增及测序分析,证明2个SNP位点上的序列与KASP分型结果一致。结论新建的KASP血型鉴定方法准确性高,可用于实验恒河猴与食蟹猴的ABO血型的快速检测。该方法相较于传统的血清学或测序方法,简单快捷,经济可靠,结果易于判读,同时对样本的要求比传统的血清学方法低,新鲜或存放较久的全血、唾液或核酸等都可以用于检测。

竞争性等位基因特异性PCR在药物相关基因多态性检测中的优化及评价

目的建立1种简便易用的药物基因组学检测方法,并对其进行评价。方法基于竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(KASP)技术,重新设计通用荧光探针,通过华法林个体化用药相关基因CYP2C9*3(rs1057910)的阳性序列和临床生物样本进行验证。结果Cal Red 610、Quasar 670的KASP测定CYP2C9*3华法林个体化用药相关基因结果准确,每个反应中最低可检出31个拷贝,在小规模的初步验证中实现了100%的特异性和灵敏度。结论Cal Red 610、Quasar 670 KASP在CYP2C9*3华法林个体化用药相关基因多态性检测中,具有高准确性、高通量、检测浓度范围宽等特点,满足生物样本的低成本临床检测的需求,比传统的Fam/Hex荧光更具优势,避免了进一步推广中对特定试剂的依赖,为进一步降低成本奠定了基础。

竞争性等位基因特异性PCR分型技术在植物抗病遗传育种中的应用

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)广泛分布在植物基因组中,位点丰富,易于实现高通量分析。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种对特定位点处的SNP以及插入和缺失(insertion-deletion,In Dels)进行双等位基因分型的技术,具有稳定性好、准确性高、无需合成特异荧光探针、检测成本较低和高通量等优点,近些年在医学和农学领域都有广泛的应用。本研究介绍了KASP技术的原理,综述了该技术在小麦等植物抗病遗传育种中的应用,并讨论了该技术的优缺点。

高粱线粒体雄性不育基因KASP标记开发

为缩短育种年限、提高育种效率及创制新种质,本研究以96份高粱不育系、保持系和恢复系为材料,通过线粒体重测序技术、表型数据与SNP位点的卡方检验,发掘与育性相关的SNP位点,并开发KASP分子标记位点。结果鉴定出与育性相关的SNP位点434个,筛选出101个位点进行卡方检验,SNP位点χ^(2)=9.574,p=0.002,其变异位点以颠换为主,整体Tv/Ts为1.55。区别出含有不育基因的材料49个,可育基因型材料47个。筛选出的SNP位点共开发出19对高质量的KASP引物,利用这些标记可以准确地区分高粱不育系和保持系,并能够鉴定出恢复系中是否含有粒线体雄性不育基因。将这些SNP位点开发成分子标记将在育种过程中节约大量的人工和时间成本,并提高准确度。

KASP标记技术在作物基因定位中的应用进展

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是基于下一代测序(next generation sequencing,NGS)发展起来的第三代分子标记,单个核苷酸的变异导致核酸序列出现多态性,具有遗传稳定性好、密度高和二等位基因型等特点,容易实现高通量和自动化检测。竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种基于SNP的无凝胶荧光聚合酶链式反应基因分型技术,已广泛应用于动植物遗传育种研究中。该研究从KASP技术在作物基因定位研究中的试验群体选择及具体应用策略2个方面,阐述了该技术在作物产量、品质和抗性等重要性状相关基因精细定位中的研究进展,并总结了其优缺点,提出了优化作物KASP分型技术体系和建立功能基因多态性位点KASP数据库等建议,进一步推广其应用,旨在为作物性状遗传调控研究提供参考依据,加快作物从传统的经验育种到精准育种转化。

桃花花型(铃形/蔷薇形)基因型鉴定、分子标记开发与利用

【目的】进一步完善桃花型基因型分类,开发桃花型相关分子标记,为观赏桃花的分子辅助育种提供理论支持。【方法】利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)、IGV可视化软件分析,以及竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele-specific PCR,KASP)技术,在定位到的候选位点进行鉴定分析。【结果】GWAS定位分析在Pp08:14518604~14521291 bp存在一个ms179810转座子的缺失,x2验证结果表明,转座子的插入与缺失与花型性状无显著性关系。在转座子上游33980 bp处鉴定到一个单碱基核苷酸(SNP)变异,变异类型分为CC型、AC型、AA型3种,比对结果显示基因型为CC型、AC型,其表型为铃形,基因型为AA型,其表型为蔷薇形,在145份桃自然群体中鉴定准确率为98.62%。但是通过表型比对发现,基因型为CC时,铃形花冠直径为(1.54±0.46)cm,同时,基因型杂合的中蟠17号自交群体后代192株中基因型与表型准确率在98.44%。【结论】根据桃基因组中Pp08:14484624 bp处的变异类型以及桃花型的调查结果,首次将铃形花基因型细分为纯合铃形和杂合铃形,且开发了同时鉴定纯合铃形、杂合铃形及蔷薇形的分子标记。

烟草种质基因分型核心SNP标记的开发

基于KASP(kompetitive allele specific PCR)技术平台,开发并验证可用于烟草核心种质基因分型的SNP(single nucleotide polymorphism)标记和对应检测引物,为烟草种质基因型鉴定评价、遗传多样性分析、核心种质筛选等提供技术和数据支持。利用Python和Perl脚本程序对覆盖烟草全基因组的1 179 154个SNP位点进行KASP引物设计和筛选,并通过试验验证其准确度和可用性。结果共有217 621个SNP位点完成了对应KASP引物设计,选择1 378个SNP位点进行试验验证,明确了732个可作为SNP标记,并确定48个SNP标记作为烟草种质资源基因分型的核心标记。这48个核心标记在烟草24条染色体上平均分布,平均PIC为0.36,平均MAF为0.39。利用确定的48个核心SNP标记,可以将各供试种质特别是将当前主栽烟草品种基因型进行区分,且标记具有极高的可靠性。

晚期糖基化终末产物受体、肿瘤坏死因子-α以及骨保护素的基因多态性对2型糖尿病增生期视网膜病变的影响

目的探讨晚期糖基化终产物受体(AGER)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及骨保护素(OPG)基因的单核苷酸多态性(SNPs)对2型糖尿病(T2DM)人群发生增生期视网膜病变的影响。方法选取2019年1月至2020年9月在桂林医学院附属医院就诊的700例T2DM患者作为研究对象,将其分为非糖尿病视网膜病变(NDR)组(n=386)和增生期糖尿病视网膜病变(PDR)组(n=314)。收集临床基本资料,取患者外周血,用竞争性等位基因特异性PCR基因分型检测法检测两组患者外周血中AGER基因rs1800625位点、TNF-α基因rs1800629位点以及OPG基因rs3134069位点的基因型。用logistic多因素回归分析模型分析这3个基因的多态性对T2DM患者发生PDR的影响。结果两组患者临床指标的收缩压、胰岛素使用与否及肾小球滤过率(GFR)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。排除以上混杂因素后,在显性模型下,rs1800625位点的AG+GG基因型和rs3134069位点的AA基因型均是PDR易感性的独立影响因素(P<0.05);两组rs1800629位点中的三种基因型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论rs1800625位点以及rs3134069位点多态性对T2DM人群PDR的发生产生影响,可能是该人群发生PDR的独立影响因素。

竞争性特异等位基因PCR检测山东甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯的抗性

为明确山东地区甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯抗性水平,采用竞争性特异等位基因PCR方法,检测甜菜夜蛾钠离子通道基因片段上L1014F的突变频率。结果表明,敏感种群个体中均未发现突变个体;田间章丘种群92%个体具有L1014F突变,其中64%为L1014F突变纯合子,28%为L1014F突变杂合子。经高效氯氰菊酯汰选5代后的抗性种群检测个体中均未发现敏感型纯合子。安丘种群的L1014F突变等位基因频率最高,为85%,泰安、滕州和滨州种群分别为50%、43.33%和30%,相关性分析表明甜菜夜蛾L1014F突变等位基因频率与对高效氯氰菊酯不敏感度呈线性正相关(Y=1.106x+0.079,R2=0.93)。

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primerARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。

不同绵羊品种FSHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

旨在探究阿勒泰羊、和田红羊、吐鲁番黑羊中FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A、g.75320741G>A突变位点的多态性与产羔数的关系,为高繁殖力绵羊的选育提供新的分子标记。利用竞争性等位基因特异性PCR(The kompetitive allele specific PCR genotyping system,KASP)技术对FSHR基因的3个突变位点进行分型,利用SPSS 19.0进行关联分析。结果表明,g.75132817C>T位点在3个群体中均表现为中度多态(025<PIC<0.5);g.75320579G>A和g.75320741G>A位点在3个群体中均为低度多态(PIC<0.25)。g.75132817C>T位点中,和田红羊突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体(P<0.05)。g.75320579G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数显著高于杂合型GA个体。g.75320741G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数极显著高于杂合型GA个体和突变型AA个体;吐鲁番黑羊突变型AA个体产羔数显著高于野生型GG个体。因此,推测FSHR基因g.75132817C>T位点适用于和田红羊产羔数的选育;g.75320741G>A位点适用于吐鲁番黑羊产羔数的选育。

凝血相关基因多态性与下肢深静脉血栓形成的相关性

目的探讨rs1799963(凝血因子V基因Leiden)、rs6025(凝血酶原基因G20210A)、rs1042579(血栓调节蛋白基因c.1418C>T)及rs1801131(亚甲基四氢叶酸还原酶基因)4个凝血相关基因的多态性与下肢深静脉血栓形成的相关性。方法采用竞争性等位基因特异性聚合酶链反应(kompetitive allele specific polymerase chain reaction,KASP)技术检测150例下肢深静脉血栓患者及153例健康对照者上述4个基因分型,采集相关血液生物化学指标,建立二元Logistic回归筛选下肢深静脉血栓形成的独立危险因素,校正混杂因素后在不同遗传模式下分析下肢深静脉血栓与各指标及4种凝血相关基因多态性的相关性。结果D-二聚体、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、性别、年龄这5个变量可能是下肢深静脉血栓形成的危险因素。将这些变量引入4种基因遗传模式,在二元Logistic回归环境下进行校正,结果显示,rs1042579突变在显性遗传模式下与下肢深静脉血栓形成具有相关性。结论rs1799963、rs6025、rs1801131的基因多态性与下肢深静脉血栓形成无明显相关性,rs1042579的基因多态性在显性遗传模式下发挥作用,可能是下肢深静脉血栓形成的独立危险因素。

A2纯合基因型荷斯坦奶牛的筛选

为了筛选A2纯合基因型荷斯坦奶牛,对全群奶牛进行基因分型,研究A2纯合基因型奶牛占全群的比例,试验在宁夏平吉堡奶牛场随机选取504头荷斯坦奶牛进行尾根采血,在实验室提取DNA后,采用超微量核酸蛋白测定仪进行纯度检验,然后对所提取的DNA采用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)方法进行基因分型。结果表明:被检测荷斯坦奶牛中A2纯合基因型奶牛占38.49%,A1A2杂合基因型奶牛占48.21%,A1纯合基因型奶牛占13.29%。A2纯合基因型奶牛的比例约占全群三分之一,但仍少于西方国家。说明KASP方法可以对奶牛基因型进行高效快速筛选,根据筛选出纯合的A2基因型奶牛,组建A2纯合基因型奶牛群。

高通量基因型分型技术及其在水稻中的应用

作物种质资源遗传基础的深入认识与高效利用,对于品种改良和粮食安全具有重要意义。传统系谱考察的方法对指导育种实践发挥了重要作用,随着分子生物学的发展,基因组学和高通量SNP分子标记等基因型分型方法可以更便捷地对种质资源进行鉴定。就基因型分型的主要方法进行了总结,重点论述了以SNP为核心的下一代高通量测序(NGS)分型方法、竞争性等位基因特异性PCR(KASP)和SNP芯片系统,以及当前主流的SNP分析工具和数据库。同时,介绍了高通量SNP分型技术在水稻研究中的进展,并就分型技术在作物育种等领域的应用和发展趋势进行了展望。

基于简化基因组的甜叶菊分子标记开发

本研究旨在筛选和开发具有多态性的甜叶菊基因组分子标记。选取4个甜叶菊品种为材料,利用简化基因组测序技术(RAD-seq)开发SSR和SNP标记。开发并验证了149对多态性丰富、重复性好、特异性高的简单重复序列(SSR)和4组功能性的SNP标记,开发的多态性基因组分子标记中包含了甜叶菊糖苷合成途径关键基因的新标记StKASPSNP-7。验证了基于KASP技术开发甜叶菊功能SNP标记的可行性,为甜叶菊遗传图谱构建、分子鉴定奠定了基础。本研究开发的SSR和SNP标记可应用于甜叶菊的遗传图谱分析、品种真实性的高效快速鉴定以及高糖苷含量新品种的开发。

EDN1和CFH的基因多态性与2型糖尿病增生性视网膜病变的相关性

目的:探讨基因多态性与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者发生增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的相关性。方法:2019年1月至2020年9月桂林医学院附属医院收治的700名T2DM患者,分为无糖尿病性视网膜病变(non-diabetic retinopathy,NDR)组(n=386)与PDR组(n=314)。收集临床基本资料,抽取患者外周血,使用竞争性等位基因特异性聚合酶链反应(kompetitive allele specific polymerase chain reaction,KASP)基因分型检测法检测两组患者血清中的内皮素-1(endothelin 1,EDN1)基因的rs5370位点和补体因子H(complement factor H,CFH)基因的rs800292位点基因型。用logistic回归分析这2个基因位点的多态性与广西汉族T2DM患PDR的关系。结果:收缩压、使用胰岛素治疗以及肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)的分析结果显示两组间差异有统计学意义(P_(收缩压)=0.025,P_(胰岛素)=0.001,P_(GFR)=0.013)。排除以上混杂因素后,EDN1基因的rs5370位点上TT基因型与PDR易感性呈正相关(P=0.03,OR=2.973;adj.P=0.011,OR=2.718);CFH基因的rs800292位点上AA基因型与PDR易感性呈正相关(P=0.037,OR=1.949;adj.P=0.044,OR=2.058)。结论:收缩压增高、GFR降低可能与T2DM患者发生PDR相关。EDN1基因的rs5370位点与CFH基因的rs800292位点的多态性与广西汉族人群的PDR易感性显著相关。

中国荷斯坦牛常见遗传缺陷筛查

遗传缺陷导致的胚胎死亡和犊牛出生缺陷是影响奶牛繁育效率的原因之一。本研究利用新开发的HH2分子检测技术,并整合已建立的其他9种缺陷基因的检测方法,在3个牛场共946头荷斯坦牛中筛查10种遗传缺陷,探析遗传缺陷在我国荷斯坦牛群中的分布。结果显示,BS、CVM、HCD、HH1、HH2、HH3、HH5、HH6携带率分别为3.81%、2.43%、5.39%、4.12%、0.53%、7.61%、6.89%、0.95%,未发现BLAD、HH4的携带者。至少携带1种遗传缺陷的个体高达266头,占总数的28.12%;携带2种遗传缺陷的个体为34头,占总数的3.59%,表明当前荷斯坦牛群体总体携带者数量大,遗传风险不能忽视,且存在多种遗传缺陷共同的隐患。建议奶牛场及时评估牛群遗传缺陷风险,采取科学的选种选配措施,逐步淘汰遗传缺陷携带者,从而避免遗传缺陷对奶牛繁育性能的负面效应。

一个辣椒胞质雄性不育SCAR标记的KASP转化及其应用

为了在辣椒三系杂交育种研究中缩小群体筛选范围,减小工作量,提高不育系和保持系选择效率,根据细胞质育性标记SCAR130的序列多态性位点设计KASP标记引物,使其转化为KASP130分子标记,并以辣椒三系材料的雄性不育系、保持系、恢复系和F 1杂交种为试验对象,利用荧光定量PCR仪LC480和LGC公司的SNPline这两种检测平台将KASP130标记应用于辣椒细胞质类型检测,并对该标记稳定性和可靠性进行了检验。结果表明,KASP130标记同SCAR130标记一样可以把待试辣椒材料准确地分为可育细胞质(N)和不育细胞质(S),并在分子标记辅助选择育种中成功应用到辣椒细胞质育性的早期鉴定以及辣椒保持系和雄性不育系的回交育种研究。综上,细胞质育性标记SCAR130已经被成功转化为KASP130分子标记,该标记可以明确鉴定辣椒的细胞质类型,这为其在辣椒三系杂交育种上的应用奠定了研究基础。