猪萨佩罗病毒聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)是引发猪腹泻的重要病毒之一。为开发一种能快速、准确检测PSV的聚合酶链式反应检测方法,针对PSV的保守区3D基因设计了一对特异性引物,优化了聚合酶链式反应退火温度,分析聚合酶链式反应检测方法特异性和灵敏度,并应用于猪场样品检测。结果表明:建立的聚合酶链式反应检测方法可特异性扩增出PSV目的片段,对其他非靶标猪腹泻病毒则无条带产生,检测低限为5拷贝/μL;在浙江地区采集的88个健康猪粪便样本中检测PSV阳性率为7.95%。该PSV聚合酶链式反应检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于PSV前期诊断和防控。

蜡样芽孢杆菌特异性基因筛选及聚合酶链式反应检测方法的建立

该研究以蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的基因组为模板,利用比较基因组学方法筛选并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证获得3个蜡样芽孢杆菌的特异性基因,用于食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测,并对引物的特异性、灵敏度、抗干扰能力和人工污染检测限等进行评价。结果表明,筛选获得的3个基因片段特异性较好。其中以gene2626设计的引物gFA2特异性最好,检测灵敏度可达359. 5 fg/μL。抗干扰评价结果表明在牛肉背景菌群浓度5. 28×10^7CFU/m L和猪肉背景菌群浓度7. 75×10^6CFU/m L的干扰下,蜡样芽孢杆菌的最低检出限为3. 74×10^3CFU/m L。人工污染试验结果表明,蜡样芽孢杆菌经增菌培养10 h后,人工污染的牛肉和猪肉样品中蜡样芽孢杆菌的检出限分别为4. 62和8. 38 CFU/g。因此该研究筛选的特异性基因及建立的PCR检测方法在食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测方面具有一定的应用潜力。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

两种聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中的应用比较

目的比较TaqTMHotStarDNA聚合酶和TspTMPlatinum DNA聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中的应用效果。方法取120例抗血栓治疗患者全血进行DNA提取、多重PCR扩增,将产物分2份,1份用TaqTMHotStarDNA聚合酶进行等位基因特异性引物延伸,1份用TspTMPlatinum DNA聚合酶进行等位基因特异性引物延伸,然后进行杂交反应,用Luminex 200系统检测CYP2C19基因多态性,同时将所有样本送第三方进行基因测序。结果TaqTMHotStarDNA聚合酶组检测结果与测序结果完全一致,TspTMPlatinum DNA聚合酶则会出现一些偏差,说明TaqTMHotStarDNA聚合酶参与的检测结果分辨率明显高于TspTMPlatinum DNA聚合酶参与的检测结果。结论两种聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中均可以取得一定的检测结果,但是为了结果的可靠性建议在检测过程中使用TaqTMHotStarDNA聚合酶。

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.

氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增效率、灵敏度和特异性的影响

以人类基因组DNA和志贺氏菌粗制裂解菌液为模板,扩增115 bp的Alu基因片段和402 bp的ipaH基因片段.通过设置氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和模板的浓度为变量,分别研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增效率和灵敏度的影响;运用多轮PCR扩增方法研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增特异性的影响.结果显示,氧化石墨烯有效提高PCR扩增效率的范围为9—14倍,提高PCR灵敏度一个数量级以及增加多轮PCR扩增中的两轮扩增反应.从原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)的结果可以看出,本文制备的氧化石墨烯片层厚度主要集中在0.5—0.8 nm,少数大于1 nm,总体具有较大的比表面积.除此之外,本文还发现当氧化石墨烯浓度到达μg·μL^(-1)后,引物二聚体与氧化石墨烯的浓度呈正比,说明氧化石墨烯优化PCR的主要影响因素是其与引物的相互作用.

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变

目的:建立检测胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因6种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中CETP基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA3种基因型,I405V(A→G)突变位点可检测出AA、AG、GG3种基因型,D442G(A→G)突变位点可检测出AA、AG2种基因型,但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型,用等位基因特异性PCR鉴定的CETP基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定CETP基因突变类型的可行方法。

等位基因特异性多重PCR快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的初步研究

目的建立等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele-specific PCR,MAS-PCR)技术,以快速检测结核分枝杆菌对喹诺酮的耐药性。方法根据结核分枝杆菌gyrA基因序列,分别设计4条特异性寡聚核苷酸引物,优化PCR条件,建立针对gyrA基因90和94位点突变进行检测的MAS-PCR技术,对临床分离菌株进行喹诺酮耐药性检测,同时以比例法和DNA直接测序法做对照。结果共对144株喹诺酮敏感株和56株喹诺酮耐药株进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法比较,敏感性为53.57%(30/56);与DNA测序比较,敏感性为71.43%(30/42),特异性均为100%(144/144)。结论 MAS-PCR技术检测结核分枝杆菌对喹诺酮耐药性简便、快速、特异性高,但敏感性需进一步提高。

等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价

目的建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用。方法等位基因特异性PCR方法。结果等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3′端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系。高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性。结论等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法。

等位基因特异性PCR技术及其法医学应用

等位基因特异性PCR(allele-specific polymerase chain reaction,AS-PCR)是一种基于等位基因特异性引物引导的PCR技术,可以有效地分析单核苷酸多态性(SNP),包括碱基的转换、颠换以及插入/缺失多态性,在疾病研究、分子诊断以及法医物证学研究中具有很好的应用价值。本文系统地综述了AS-PCR技术的原理、检测手段、改进方法及在常染色体、Y染色体和线粒体SNP等领域的研究成果,探讨其法医学应用价值。

应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变

目的:建立检测血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因2种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对AGT基因T174M和M235T这2种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中AGT基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型,M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型,用等位基因特异性PCR鉴定的AGT基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定AGT基因突变类型的可行方法。

新西兰柔鱼与北太平洋柔鱼的品种特异性聚合酶链式反应鉴定

利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因,通过多重序列比对检测2种鱿鱼之间的多态性位点。根据2种鱿鱼的特异性位点分别设计2种鱿鱼的品种特异性引物,并利用多重PCR实现2种鱿鱼品种的特异性鉴定和区分。结果表明:建立的品种特异性PCR鉴别体系对新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼分别扩增出214 bp和339 bp的品种特异性条带,该方法的检测限低至0.1 ng,且能检测出新西兰柔鱼中1%的北太平洋柔鱼掺入,并能有效检测市场上2种鱿鱼及其复配鱼糜制品的原料来源。

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。

二球悬铃木花粉变应原特应性体质与HLA-DRB1等位基因相关性分析

目的建立对二球悬铃木花粉过敏的特应性体质者的HLA-DRB1等位基因的PCR-SSP检测方法,探讨江苏汉族人二球悬铃木花粉变应原特应性体质者与HLA-DRB1等位基因的相关性。方法用酚-氯仿法提取全血DNA,合成8对等位基因特异性引物,用PCR-SSP方法检测20例江苏汉族二球悬铃木花粉过敏体质者和36例健康人HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0406,*0407,*0408等位基因。结果经优化实验条件,建立了HLA-DRB1的8个等位基因的PCR-SSP检测方法,获得了患者组和健康人组上述HLA-DRB1等位基因的分布资料。二球悬铃木花粉变应原特应性体质者DRB1*0405和*0406基因频率高于健康人对照组而DRB1*0402基因频率低于健康人对照组。其他5个等位基因频率二组间无显著性差异。结论HLA-DRB1*0406和*0405可能是对二球悬铃木花粉变应原过敏的I型变态反应特应性体质者的可疑候选易患等位基因,而DRB1*0402基因可能是与之相关的具有抵抗作用的等位基因。

聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究

本研究依据编码猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,合成了一对寡核苷酸引物,通过减少病毒核酸的提取时间、费用及优化聚合酶链式反应(PCR)的条件,成功地从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中扩增出预期的158bp片段,经EcoRⅠ酶切鉴定,证实了该扩增片段的特异性。经敏感性试验测定,PCR的最低检出量为0 008病毒血凝(HA)单位。这些结果表明本试验建立的PCR对PPV的检测人有快速、简便、经济、灵敏度高和特异性强的特点。

基于性状鉴别和特异性PCR技术对膨腹海马的鉴别研究

目的:采用性状鉴别和聚合酶链式反应(PCR)技术对我国主要的海马养殖品膨腹海马Hippocampus abdominalis Leeson进行研究,为该品种鉴别技术开发提供数据支持。方法:通过查阅文献资料并结合样品统计观察,总结膨腹海马的性状鉴别特征;根据膨腹海马及其他海马的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,筛选出膨腹海马的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计专属膨腹海马的引物PFHM-Primer-F和PFHM-Primer-R。通过优化PCR体系反应条件,考察最佳的PCR反应体系。结果:膨腹海马的核心性状特征主要包括有较多的体环、尾环和背鳍条数,背鳍覆盖4个体环+1个尾环;眼周和鳃盖部具有明显的大而黑的斑点等。基于COⅠ序列展开的PCR鉴别方法研究表明,当退火温度为65℃,循环30次时,膨腹海马样品在100~250 bp呈现单一明亮条带,而其他品种均无此条带。结论:建立的性状鉴别和特异性PCR鉴别方法可快速鉴别膨腹海马,为我国海马新资源的鉴别和后续开发提供参考。

醋龟甲配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的:建立一种醋龟甲配方颗粒特异性位点聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:根据乌龟Chinemys reevesii(Gray)及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列上的单核苷酸多态性位点设计醋龟甲的特异性鉴别引物,经过优化反应体系,确定最佳的PCR反应条件,并对该方法进行耐受性和适用性考察。结果:当退火温度为62℃、循环数为34时,醋龟甲饮片、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均可在约92 bp处得到清晰单一的特异性条带,其混伪品及阴性对照均无条带。结论:建立的位点特异性PCR鉴别方法可快速、准确地鉴别醋龟甲饮片、标准汤剂冻干粉和配方颗粒的真伪,为醋龟甲配方颗粒质量标准研究提供了参考。

聚合酶链式反应诊断肺炎支原体感染

聚合酶链式反应诊断肺炎支原体感染太原市人民医院（０３０００１）韩志英山西省妇幼保健院米燕萍肺炎支原体（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）是小儿呼吸道感染主要病原之一。以往支原体肺炎的诊断主要依靠人工培养方法和血清学方法，但它们都缺乏早期...