基于竞争性等位基因特异性PCR技术的麦芽品种纯度定性和定量检测

利用测序技术筛选和确认4个可以区分7种大麦麦芽的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,并建立区分图谱。同时,利用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应检测技术对预混样品进行定量测试,其检测的结果与真实性之间相对误差小于3%。该技术的建立对大麦麦芽纯度检测提供方法,对大麦麦芽SNP指纹数据库的完善提供了数据支持。

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primerARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。

武汉汉族8个Y染色体双等位基因标记遗传多态性

目的筛选汉族群体中具有多态性的Y染色体双等位基因标记并研究其等位基因及单体群频率分布, 为法医学应用和群体进化研究提供基础数据。方法采用片段长度差异等位基因特异性PCR和PAGE技术对武汉地区160名男性汉族无关个体的8个Y染色体双等位基因标记(M9、M89、M111、M119、M122、M134、IMS-JST003305 和SRY+465)进行分型。结果 8个双等位基因标记在武汉汉族群体中均具有遗传多态性,其基因多样性(GD)范围为 0．0126-0．4830,共检出9种不同单体群(Hg1～9),其单体群多样性(HD)为0．7776。结论 8个Y染色体双等位基因标记组成的单体群在法医学应用和群体进化研究中具有一定的实用价值,可作为Y-STRs标记的有效补充。

桃花花型(铃形/蔷薇形)基因型鉴定、分子标记开发与利用

【目的】进一步完善桃花型基因型分类,开发桃花型相关分子标记,为观赏桃花的分子辅助育种提供理论支持。【方法】利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)、IGV可视化软件分析,以及竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele-specific PCR,KASP)技术,在定位到的候选位点进行鉴定分析。【结果】GWAS定位分析在Pp08:14518604~14521291 bp存在一个ms179810转座子的缺失,x2验证结果表明,转座子的插入与缺失与花型性状无显著性关系。在转座子上游33980 bp处鉴定到一个单碱基核苷酸(SNP)变异,变异类型分为CC型、AC型、AA型3种,比对结果显示基因型为CC型、AC型,其表型为铃形,基因型为AA型,其表型为蔷薇形,在145份桃自然群体中鉴定准确率为98.62%。但是通过表型比对发现,基因型为CC时,铃形花冠直径为(1.54±0.46)cm,同时,基因型杂合的中蟠17号自交群体后代192株中基因型与表型准确率在98.44%。【结论】根据桃基因组中Pp08:14484624 bp处的变异类型以及桃花型的调查结果,首次将铃形花基因型细分为纯合铃形和杂合铃形,且开发了同时鉴定纯合铃形、杂合铃形及蔷薇形的分子标记。

烟草种质基因分型核心SNP标记的开发

基于KASP(kompetitive allele specific PCR)技术平台,开发并验证可用于烟草核心种质基因分型的SNP(single nucleotide polymorphism)标记和对应检测引物,为烟草种质基因型鉴定评价、遗传多样性分析、核心种质筛选等提供技术和数据支持。利用Python和Perl脚本程序对覆盖烟草全基因组的1 179 154个SNP位点进行KASP引物设计和筛选,并通过试验验证其准确度和可用性。结果共有217 621个SNP位点完成了对应KASP引物设计,选择1 378个SNP位点进行试验验证,明确了732个可作为SNP标记,并确定48个SNP标记作为烟草种质资源基因分型的核心标记。这48个核心标记在烟草24条染色体上平均分布,平均PIC为0.36,平均MAF为0.39。利用确定的48个核心SNP标记,可以将各供试种质特别是将当前主栽烟草品种基因型进行区分,且标记具有极高的可靠性。

竞争性等位基因特异性PCR分型技术在植物抗病遗传育种中的应用

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)广泛分布在植物基因组中,位点丰富,易于实现高通量分析。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种对特定位点处的SNP以及插入和缺失(insertion-deletion,In Dels)进行双等位基因分型的技术,具有稳定性好、准确性高、无需合成特异荧光探针、检测成本较低和高通量等优点,近些年在医学和农学领域都有广泛的应用。本研究介绍了KASP技术的原理,综述了该技术在小麦等植物抗病遗传育种中的应用,并讨论了该技术的优缺点。

ABO基因荧光标记复合AS-PCR分型的法医学应用研究

1990～1993年,Yamamoto等[1～3]通过对ABO基因的系列分析研究,发现了各等位基因核苷酸序列差异,为从分子水平进行ABO基因分型打下了基础.以后,国内外学者先后建立了PCR-RFLP、AS-PCR、直接测序等多种ABO基因分型方法.本文根据G.Watanabe等人报道[4],通过AS-PCR方法荧光标记复合扩增ABO基因型,并对其在法医学中的应用加以研究.现报道如下:……

基于表型性状和KASP标记的玉米DUS测试品种的聚类分析

为探讨竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记在玉米DUS(特异性、一致性和稳定性)测试过程中近似品种筛选方面的应用,采用表型和KASP标记对玉米测试品种进行聚类分析。表型的二阶聚类结果显示,315份玉米品种可划分为普通型、甜质型以及糯质型和甜糯混合型3类,“籽粒:类型”性状对聚类结果的影响最大;系统聚类结果显示,单交种和自交系间的分离比较明显,普通型玉米与甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米间的分离也较明显,甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米三者之间的分离不明显。KASP标记聚类结果显示,自交系与单交种交织在一起,普通型玉米与甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米间明显分离,甜质型玉米与糯质型、甜糯混合型玉米间的分离也较明显,糯质型玉米和甜糯混合型玉米相互交织。综上分析可知,在繁殖类型上单交种和自交系表型聚类结果与KASP标记聚类结果不同,而在籽粒类型上2种聚类结果基本吻合。

一个辣椒胞质雄性不育SCAR标记的KASP转化及其应用

为了在辣椒三系杂交育种研究中缩小群体筛选范围,减小工作量,提高不育系和保持系选择效率,根据细胞质育性标记SCAR130的序列多态性位点设计KASP标记引物,使其转化为KASP130分子标记,并以辣椒三系材料的雄性不育系、保持系、恢复系和F 1杂交种为试验对象,利用荧光定量PCR仪LC480和LGC公司的SNPline这两种检测平台将KASP130标记应用于辣椒细胞质类型检测,并对该标记稳定性和可靠性进行了检验。结果表明,KASP130标记同SCAR130标记一样可以把待试辣椒材料准确地分为可育细胞质(N)和不育细胞质(S),并在分子标记辅助选择育种中成功应用到辣椒细胞质育性的早期鉴定以及辣椒保持系和雄性不育系的回交育种研究。综上,细胞质育性标记SCAR130已经被成功转化为KASP130分子标记,该标记可以明确鉴定辣椒的细胞质类型,这为其在辣椒三系杂交育种上的应用奠定了研究基础。

KASP分子标记辅助选育甜椒核雄性不育两用系

为了进一步提高甜椒核雄性不育两用系育种效率,利用AB91核雄性不育候选基因Capana05g000747的突变位点设计KASP分子标记,以转育甜椒核雄性不育两用系的F_(2)群体及育成的两用系为试验材料,对植株的育性进行基因型检测,并检验该标记的准确性。结果表明,该分子标记与甜椒核雄性不育的育性呈现共分离,在苗期对F_(2)植株的基因型进行早期鉴别,分型准确率分别为98.91%和99.04%,可有效淘汰基因型为MSMS的可育株,筛选出基因型为MSms的可育株直接用于不育系的转育,转育出了黄色和红色甜椒核雄性不育两用系AB91-HTJ412和AB91-HLD163。在苗期对两用系群体的育性基因型进行早期鉴别,可有效淘汰基因型为MSms的可育株,选留基因型为msms的不育株直接用于杂交组合选配及杂交制种。

基于简化基因组的甜叶菊分子标记开发

本研究旨在筛选和开发具有多态性的甜叶菊基因组分子标记。选取4个甜叶菊品种为材料,利用简化基因组测序技术(RAD-seq)开发SSR和SNP标记。开发并验证了149对多态性丰富、重复性好、特异性高的简单重复序列(SSR)和4组功能性的SNP标记,开发的多态性基因组分子标记中包含了甜叶菊糖苷合成途径关键基因的新标记StKASPSNP-7。验证了基于KASP技术开发甜叶菊功能SNP标记的可行性,为甜叶菊遗传图谱构建、分子鉴定奠定了基础。本研究开发的SSR和SNP标记可应用于甜叶菊的遗传图谱分析、品种真实性的高效快速鉴定以及高糖苷含量新品种的开发。

晚期糖基化终末产物受体、肿瘤坏死因子-α以及骨保护素的基因多态性对2型糖尿病增生期视网膜病变的影响

目的探讨晚期糖基化终产物受体(AGER)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及骨保护素(OPG)基因的单核苷酸多态性(SNPs)对2型糖尿病(T2DM)人群发生增生期视网膜病变的影响。方法选取2019年1月至2020年9月在桂林医学院附属医院就诊的700例T2DM患者作为研究对象,将其分为非糖尿病视网膜病变(NDR)组(n=386)和增生期糖尿病视网膜病变(PDR)组(n=314)。收集临床基本资料,取患者外周血,用竞争性等位基因特异性PCR基因分型检测法检测两组患者外周血中AGER基因rs1800625位点、TNF-α基因rs1800629位点以及OPG基因rs3134069位点的基因型。用logistic多因素回归分析模型分析这3个基因的多态性对T2DM患者发生PDR的影响。结果两组患者临床指标的收缩压、胰岛素使用与否及肾小球滤过率(GFR)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。排除以上混杂因素后,在显性模型下,rs1800625位点的AG+GG基因型和rs3134069位点的AA基因型均是PDR易感性的独立影响因素(P<0.05);两组rs1800629位点中的三种基因型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论rs1800625位点以及rs3134069位点多态性对T2DM人群PDR的发生产生影响,可能是该人群发生PDR的独立影响因素。

不同绵羊品种FSHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

旨在探究阿勒泰羊、和田红羊、吐鲁番黑羊中FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A、g.75320741G>A突变位点的多态性与产羔数的关系,为高繁殖力绵羊的选育提供新的分子标记。利用竞争性等位基因特异性PCR(The kompetitive allele specific PCR genotyping system,KASP)技术对FSHR基因的3个突变位点进行分型,利用SPSS 19.0进行关联分析。结果表明,g.75132817C>T位点在3个群体中均表现为中度多态(025<PIC<0.5);g.75320579G>A和g.75320741G>A位点在3个群体中均为低度多态(PIC<0.25)。g.75132817C>T位点中,和田红羊突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体(P<0.05)。g.75320579G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数显著高于杂合型GA个体。g.75320741G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数极显著高于杂合型GA个体和突变型AA个体;吐鲁番黑羊突变型AA个体产羔数显著高于野生型GG个体。因此,推测FSHR基因g.75132817C>T位点适用于和田红羊产羔数的选育;g.75320741G>A位点适用于吐鲁番黑羊产羔数的选育。

高通量基因型分型技术及其在水稻中的应用

作物种质资源遗传基础的深入认识与高效利用,对于品种改良和粮食安全具有重要意义。传统系谱考察的方法对指导育种实践发挥了重要作用,随着分子生物学的发展,基因组学和高通量SNP分子标记等基因型分型方法可以更便捷地对种质资源进行鉴定。就基因型分型的主要方法进行了总结,重点论述了以SNP为核心的下一代高通量测序(NGS)分型方法、竞争性等位基因特异性PCR(KASP)和SNP芯片系统,以及当前主流的SNP分析工具和数据库。同时,介绍了高通量SNP分型技术在水稻研究中的进展,并就分型技术在作物育种等领域的应用和发展趋势进行了展望。

猪粪便污染特异性分子标记筛选及其PCR检测方法的建立

肠道微生物群落在与其宿主长期协同进化过程中会形成大量的宿主-肠道微生物互作基因,这些互作基因具有一定的宿主肠道微生物特异性,利用其设计分子标记能有效识别粪便污染源.本研究首次利用竞争性杂交的方法富集猪粪便特异性基因,从中筛选出具有猪粪便特异性的基因片段,以此设计引物并建立相应的PCR检测方法,并对采集样进行应用调查.竞争性杂交富集的猪粪便特异性基因文库以拟杆菌群(Bacteroidetes)(43.2%)和梭状杆菌群(Clostridia)(19.5%)相似序列为主,其蛋白功能主要分为3大类:与信息贮存与加工有关(7.6%),与细胞加工及信息传导有关(12.8%)以及与代谢有关(22.0%).进一步针对功能蛋白序列筛选宿主粪便特异性分子标记.分析表明序列3-53-2对应引物可作为猪粪便污染的特异性分子标记,针对其建立的常规PCR方法对粪便DNA的检出限可低至0.01 ng·μL-1,且对实际样品具有较高的应用灵敏性(97%)和特异性.进一步对可能受污染水样进行猪粪便污染特异性检测,结果显示不同地区的阳性检出率高达75%~100%,证明了此方法的有效性,可为研究微生物示踪技术在非点源污染方面的应用提供一定的基础数据.

中国荷斯坦牛常见遗传缺陷筛查

遗传缺陷导致的胚胎死亡和犊牛出生缺陷是影响奶牛繁育效率的原因之一。本研究利用新开发的HH2分子检测技术,并整合已建立的其他9种缺陷基因的检测方法,在3个牛场共946头荷斯坦牛中筛查10种遗传缺陷,探析遗传缺陷在我国荷斯坦牛群中的分布。结果显示,BS、CVM、HCD、HH1、HH2、HH3、HH5、HH6携带率分别为3.81%、2.43%、5.39%、4.12%、0.53%、7.61%、6.89%、0.95%,未发现BLAD、HH4的携带者。至少携带1种遗传缺陷的个体高达266头,占总数的28.12%;携带2种遗传缺陷的个体为34头,占总数的3.59%,表明当前荷斯坦牛群体总体携带者数量大,遗传风险不能忽视,且存在多种遗传缺陷共同的隐患。建议奶牛场及时评估牛群遗传缺陷风险,采取科学的选种选配措施,逐步淘汰遗传缺陷携带者,从而避免遗传缺陷对奶牛繁育性能的负面效应。

利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发

本研究对202份大白菜自然群体材料进行简化基因组测序（Specific Locus Amplified Fragment Sequencing,SLAF）,并通过测序深度、SLAF标签的多态性与参考基因组的相似程度等指标的筛选,获得了全基因组均匀分布的960个SLAF分子标记。结合相应材料的霜霉病病情调查结果,利用所述960个SLAF标记进行全基因组关联分析。结果显示：（1）在A01染色体上检测到1个新的与抗霜霉病关联的SLAF标记,即SLAFMarker A0124655323;（2）根据SLAFMarker A0124655323左右两翼最近标记之间的距离确定此热点区间为A01染色体24573724~24755150的物理范围;（3）利用该区间内的一个SNP开发出适用于KASP分型技术的SNP分子标记,在各亚群选择准确率均在80%以上;（4）在此区间找到抗病相关基因13个。本研究获得的新的抗病位点和开发的SNP分子标记,将有助于大白菜抗霜霉病分子育种。

阿尔茨海默病患者载脂蛋白E 3种分型方法的比较

目的采用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)法、单碱基末端延伸(SNaPshot)法对载脂蛋白E(APOE)进行分型检测,并与Sanger测序法比较,以期获得更为高效、稳定、经济的中、高通量APOE分型手段。方法选取既往收集的覆盖全部6种常见APOE分型的阿尔茨海默病(AD)及轻度认知障碍(MCI)患者全血核酸样本48份,根据KASP法和SNaPshot法技术原理设计实验识别APOE 2个关键单核苷酸多态性(SNP)位点rs429358和rs7412,并对样本进行APOE分型检测。调整样本顺序重复检测以验证方法的稳定性和可重复性。扩大样本量,收集AD、MCI患者全血样本107份,采用上述两种方法进行APOE分型检测,Sanger测序法验证。结果采用KASP法和SNaPshot法对48份已知APOE分型样本的2次检测结果与原分型完全一致。进一步扩大样本量对107例样本进行分型检测,与Sanger测序法得到的结果完全一致。结论采用KASP法和SNaPshot法进行APOE分型检测具有快速、准确、结果直观等特点,应用中、高通量APOE分型检测相对于Sanger测序法效率更高、成本更低,具有一定推广应用价值。

广西柳州人群MYO9B rs10469470、rs11666569基因多态性特点分析

为探讨广西柳州人群肌球蛋9B（MYO9B）rs10469470、rs11666569单核苷酸基因多态性（SNP）特点及与其他地区人群的差异,我们采用竞争性等位基因特异性PCR（KASP）检测柳州地区123例健康受试者MYO9B基因rs10469470、rs11666569位点基因型。统计学方法分析基因型及等位基因分布频率及组间差异。结果表明,rs10469470位点检测出AA、AC两种基因型,分布频率分别为90.24%及9.76%,其基因型及等位基因频率在柳州人群男女性别间无显著差异（p〉0.05）。其基因型与等位基因频率与基因组单体型图计划公布的北京汉族人群（CHB）（p〉0.0125）及日本东京人群（JPT）（p〉0.0125）无显著差异。rs11666569位点检测出AA、AG、GG三种基因型,分布频率分别为9.76%、49.59%及40.65%,其基因型及等位基因频率在柳州人群男女性别间无统计学意义（p〉0.05）。其基因型与等位基因频率与CHB（p〉0.0125）及JPT（p〉0.0125）无显著差异。柳州人群MYO9B rs10469470、rs11666569单核苷酸基因多态性男女性别之间无差别,与其他种族及地区人群亦无明显差异。

广西壮族人群13个单核苷酸基因座遗传多态性

目的 采用荧光标记复合扩增单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）体系对广西地区壮族314名个体的13个SNP基因座进行等位基因频率调查，并评价其法医学应用价值。方法 选择13个常染色体双等位基因SNP基因座，应用荧光标记片段长度差异等位基因特异性复合扩增SNP分型体系，对广西地区壮族人群进行群体调查。结果 获得了广西地区壮族人群13个SNP基因座的等位基因频率，13个SNP基因座等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，杂合度位于0．2166和0．5478之间，多态信息总量位于0．2084与0．3750之间，13个SNP基因座累积个人识别几率和累积非父排除率均分别达到99．99％和87．71％。结论 用荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法可同时对多个SNP基因座进行分型；13个SNP基因座在法医学个人识别领域具有较高的应用价值。