高效毛细管电泳前沿分析法研究酸性药物那格列奈与人血浆白蛋白的结合

用高效毛细管电泳前沿分析法研究了酸性药物那格列奈与人血浆白蛋白的结合常数、结合位点和结合率。使用未涂层的毛细管柱 (4 0cm× 5 0 μmi.d .;有效柱长 32cm) ,磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.4 ,离子强度0 .17)为背景溶液 ,在紫外检测波长 2 14nm、运行电压 18kV和重力进样 10 0s的条件下 ,利用那格列奈谱峰的平台高度和游离药物浓度的良好线性关系 (r>0 .999,n =6 ) ,测定了那格列奈的游离药物浓度。固定药物浓度 (2 0 0 μmol L ,2 5 0 μmol L) ,考察不同的蛋白质浓度对结合的影响 ;固定蛋白质浓度 (10 0 μmol L) ,考察不同的药物浓度对结合的影响。实验数据采用非线性拟和程序进行处理 ,得到了那格列奈的蛋白质结合参数。高效毛细管电泳前沿分析法测定的数据重现性良好 (RSD <2 .5 % ,n =3) ,在药代动力学和药效学研究方面具有简便、准确的优点。

格列美脲蛋白结合作用的高效液相色谱迎头分析法

目的 研究格列美脲与人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)结合作用。方法 采用高效液相色谱 迎头分析法(highperformanceliquidchromatography frontalanalysis, HPLC FA)。色谱柱为内表面反相(internal surfacereversed phase,ISRP)硅胶柱PinkertonGFFII S5 80(1.50mm×4 .6mmID, 5μm);流动相为 67mmol·L-1磷酸盐等渗缓冲液 (pH 7. 4, I=0 17mol·L-1 );流速 0 2mL·min-1;检测波长 230nm;进样量 900μL;柱温37℃。结果应用非线性回归参数估算求得HSA分子上两类结合位点结合的格列美脲分子数及相应的结合平衡常数:n1 =1和K1 =5. 1 (μmol·L-1 )-1;n2 =7和K2 =0. 017 (μmol·L-1 )-1。结论 HPLC FA法操作简便,适用于研究格列美脲与HSA的结合作用。

非同位素法分析序列特异性DNA结合蛋白的三种方法

目的为在转录调控水平研究蛋白质异常表达机制,利用核转录因子与相应DNA调控序列特异结合的原理,非同位素法分析细胞内序列特异性DNA结合蛋白。方法凝胶滞留实验(EMSA)采用Dig-ddUTP末端标记DNA,核蛋白粗提或纯化产物与之液相结合后,PAGE分离核蛋白并转印至尼龙膜,化学发光法检测结果,Southwestern分析方法首先采用SDS-PAGE分离核蛋白粗提或纯化产物,蛋白转印至膜上后与Dig-dUTP末端标记的DNA杂交,酶免疫学检测结果,磁性DNA结合蛋白纯化法则将靶DNA与商品化磁性DNA粒子相连,用不同的连接、洗脱条件得到序列特异性靶DNA结合蛋白,银染显示核蛋白纯化结果。结果 EMSA中由于游离DNA与DNA-蛋白复合物有不同电泳迁移率,出现滞后DNA条带提示有识别该特定DNA序列的核蛋白存在,Southwestern分析除能提示核抽提物中有无可与DNA结合的核蛋白外,还提示其中核蛋白分子质量,核蛋白粗提物经磁性DNA亲和层析后DNA结合蛋白在银染时出现较纯的特异识别该DNA序列的核蛋白条带。结论 EMSA,Southwestern分析及磁性DNA层析是3种实用的研究DNA结合蛋白的方法,配伍应用具有简便、重复性好、敏感性和特异性高、无同位素污染等优点,是转录调控水平研究疾病相关基因异常表达的有效方法。

纤维结合蛋白透射免疫分析方法学初步评价

目的初步评价纤维结合蛋白(Fn)透射免疫分析法检测试剂盒的临床应用性能。方法根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2002年10月颁布的《定量临床检验方法的初步评价:批准指南(EP10-A2)》,连续5天按特定顺序测定高、中、低值质控血清中的Fn浓度,记录检验结果,采用Microsoft Excel软件和SPSS16.0统计软件,计算Fn测定的偏差、总不精密度,每天的多元回归分析参数(截距、斜率、非线性、携带污染率、线性漂移)的值。结果线性回归方程为:y=0.99984x-0.22,与y=x参考线几乎重合,表明测定值y与靶值x差很小,r2=0.9999,大于0.95,说明线性范围符合要求;3个浓度偏差分别为-0.40 mg/L、0.07 mg/L、-0.33 mg/L,均低于标定偏差的3.81 mg/L、10.61 mg/L和17.41 mg/L;3个浓度总不精密度分别为2.37%、0.77%、0.24%,均小于最大允许总不精密度。结论纤维结合蛋白(Fn)透射免疫分析法试剂盒达到CLSI EP10-A2文件所规定标准,符合临床应用要求。

青霉素结合蛋白在β-内酰胺类抗生素受体分析法中的应用

青霉素结合蛋白是一类广泛存在于细菌细胞膜表面的蛋白,是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶位。本文简要阐述了青霉素结合蛋白的发现与分类及其制备方法,分析比较了几种基于青霉素结合蛋白的β-内酰胺类抗生素受体分析法的优缺点,并探讨了未来可能的研究方向。

高效前沿分析法应用于药物与蛋白结合研究

综述高效前沿分析法 (HPFA)的原理、调节作用及其在药物与蛋白结合研究中的应用。HPFA可直接进样测定常规方法 (如超滤 HPLC法 )所达不到的游离药物检测浓度 ;HPFA与手性HPLC系统联用可有效地测定光学异构体的药物浓度 ;若药物峰与蛋白质峰能完全分离 ,则可分别根据平台区峰高和峰面积同时测得游离药物浓度和总药物浓度。

药物血浆蛋白结合率测定方法的研究进展

药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率，是药物代谢动力学的重要参数之一。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度和时间，并往往与药物的相互作用及作用机制等密切相关。因此，药物血浆蛋白结合率的研究无论对于新药研究开发还是指导临床合理用药都具有重要意义。研究药物血浆蛋白结合率的方法包括常规的平衡透析法、超滤法、超速离心法、凝胶过滤法等。近年来随着药代动力学及临床药理学的迅猛发展，又产生了一些新的测定方法，如微透析法、高效亲和色谱法（HPAC）、高效前沿分析（HPFA）等。笔者主要对其中的5种药物血浆蛋白结合率的测定方法进行综述。

用胭脂红酸极谱分析法测定人血清白蛋白的研究

在pH值为4.0的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,胭脂红酸在滴汞电极上-0.54V(vs.SCE)处有一个灵敏的极谱还原峰,加入人血清白蛋白(HSA)后,两者之间发生结合反应形成复合物,其还原峰电位不变,而还原峰电流明显下降。峰电流的降低与蛋白质浓度在一定范围内成正比,优化了结合反应条件和电化学测定条件,建立了测定血清白蛋白的电化学分析新方法,应用于人血清白蛋白的测定,线性范围为2.0～70.0mg·L-1。考察了共存物质的影响,并应用于人血清样品中蛋白质含量的测定,结果与传统的考马斯亮蓝G-250光度法一致。本方法简便、准确、灵敏,选择性和重复性好。

透射免疫分析检测腹膜透析患者纤维结合蛋白的临床意义

目的探讨腹膜透析患者血清纤维结合蛋白含量变化及其临床意义。方法应用透射免疫分析法测定70例尿毒症患者进行腹膜透析前后的血清纤维结合蛋白(Fn)含量,同时检测血清肌酐(Crea)、血清尿素氮(BUN)含量,并进行相关性统计分析。结果与正常对照组(223.7±11.7)mg/L比较,腹透前组(168.07±16.06)mg/L、腹透后组(191.77±17.01)mg/L Fn含量降低,差异有统计学意义(P<0.05);腹透后组与腹透前组比较,Fn水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);透析前、后Fn升高水平与Crea、BUN降低水平的变化趋势均不完全一致。结论对进行腹膜透析治疗的尿毒症期患者进行Fn水平检测,有助于监测透析患者腹膜纤维化的情况及判断患者腹膜透析的效果,可作为评估腹膜透析效果辅助指标之一。

血清纤维结合蛋白的酶免疫检测法

目的建立血清纤维结合蛋白(Fn)含量的酶免疫分析(EIA)检测方法。方法利用现有Fn检测试剂盒建立Fn的EIA测定法,并对所建立的方法从灵敏度、精密度、特异性、重复性等方面进行方法学评价。结果该法灵敏度为11．69ml／L,线性范围为50～300mg／L,批内变异系数为 3．82％,批间变异系数为5．10％,回收率97．7％。肺结核组及正常对照组血清Fn含量分别为 (188．82±5．51)mg／L和(275．25±18．11)mg／L,两组间差异有显著性意义(P<0．01);肺结核稳定期患者血清Fn显著高于进展期及好转期(P<0．05)。结论该方法线性范围适宜,准确度、精密度较好,符合临床检验工作要求。

光度分析法在研究染料与蛋白质反应中的应用

综述了吸光光度法、荧光光度法、共振散射光度法在研究蛋白质与染料结合反应机理及蛋白质测定中的应用.

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP2配体结合特性分析

为了明确小地老虎化学感受蛋白基因AipsCSP2在雌、雄成虫各组织中的表达情况,解析Aips CSP2蛋白的配体结合特性并探讨其功能。本文基于小地老虎性腺转录组数据,利用PCR技术克隆AipsCSP2基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用q PCR技术测定该基因在小地老虎雌、雄成虫不同组织中的表达水平;利用原核表达技术体外表达并纯化Aips CSP2蛋白;最后采用荧光竞争性结合试验测定该蛋白与小地老虎和其他鳞翅目昆虫性信息素组分以及主要寄主植物挥发物的结合能力。结果显示AipsCSP2基因开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为360 bp,编码119个氨基酸,氨基酸序列中具有4个保守半胱氨酸位点,是典型的化学感受蛋白;组织表达谱结果显示AipsCSP2基因在雌成虫性腺和雄成虫附腺中特异高表达,在其他组织中表达量较低;荧光竞争性结合试验结果表明,Aips CSP2蛋白和小地老虎性信息素组分顺-11-十六碳乙酸酯的合成前体顺-11-十六碳醛有着极其强的结合能力,Ki值为1.48μmol/L,此外AipsCSP2蛋白和其他鳞翅目昆虫的醇类和醛类性信息素如十四烷醇、顺-9-十六碳醛、顺-7-十六碳醛也有着极其强的结合能力,Ki值分别为1.10μmol/L、0.63μmol/L和1.51μmol/L,和小地老虎性信息素组分顺-7-十二碳乙酸酯、顺-8-十二碳乙酸酯的结合能力为中等,与小地老虎主要寄主植物挥发物结合能力较弱或不结合。推测Aips CSP2蛋白可能主要参与了小地老虎性信息素的合成与识别过程,并在生殖活动中起着重要的作用。

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的抗原结合特性分析

为了解和确定抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体所针对的抗原表位及今后的确切用途,用竞争性结合ELISA试验结合Western-blotting分析,对10株单克隆抗体的抗原结合特性进行了分析。抗体反应增值结果表明,10株单抗针对的是同一大的抗原决定簇,根据增值结果可将10株单抗分成4个亚群。除2A1外,其他9株单抗的ELISA反应增值结果与Western-blot- ting分析结果一致,认为可能是由于2A1与其他9株单抗的免疫原不同所致。

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的:随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17(Sp17)特异性结合的短肽序列,并进行鉴定。方法:以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛。富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析。结果:随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRM II、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMR IMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRR IRKQ。结论:从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列。

鱼蛋白肽钙的分级及肽与钙的结合性能研究

以白鲢采肉后的鱼骨为原料制备鱼蛋白肽钙,用无水乙醇分级分离得到6个级分:水不溶性级分CA、50%、60%、70%、80%、90%乙醇不溶性级分CB、CC、CD、CE、CF,采用红外分析法和葡聚糖凝胶色谱法等手段比较了各级分间的差异。结果表明:各级分中均含有一定量的肽和钙,6个级分可以归为3类:CA得率最高,水溶性最差,钙通过化学键与分子量较大的肽结合;CB、CC相似,得率最低,钙通过化学键与小肽或氨基酸结合;而CD、CE和CF三者相似,水溶性好,钙呈游离态,通过物理吸附作用与鱼蛋白肽结合。

利用电泳迁移分析法初步探讨肺癌细胞株CEA的转录调控

【目的】探讨癌胚抗原 (CEA)表达水平不同的肺癌细胞株在转录因子水平有无差异。【方法】利用电泳迁移分析法 (EMSA)检测这些细胞株与CEA启动子阳性足迹区探针结合的DNA结合蛋白。维甲酸 (RA)诱导分化A5 49细胞 ,检测诱导前后转录因子的变化。【结果】CEA水平高的细胞DNA结合蛋白的条带信号强 ,CEA水平低的细胞DNA结合蛋白的条带信号弱 ,CEA阴性细胞可见到较弱的DNA结合蛋白信号。结合条带信号在诱导后细胞组明显减弱。【结论】CEA基因特异性的表达部分依赖于转录因子的合成。转录因子量的改变与CEA表达的高低有关 ,并且提示RA对CEA阳性肺癌细胞的诱导是在转录水平起作用。

大鼠肝再生启动阶段肝细胞CCAAT增强子结合蛋白α mRNA、微小RNA-144-3p和3种环状RNA的表达和作用

目的了解大鼠肝再生启动阶段CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)mRNA、微小RNA(miR)-144-3p、rno-LOC100365958_0001、rno-Usp3_0010和rno-AC241873_0010调节肝细胞处于G_(0)期还是G_(1)期的途径和方法。方法按Higgins等方法制备大鼠2/3肝切除(PH)模型,按Smedsrod等方法分离肝细胞,用大规模定量分析技术检测大鼠肝再生中肝细胞竞争性内源RNA(ceRNA)表达的变化,用Cytoscape 3.2软件构建ceRNA的相互作用网络,用ceRNA综合分析等方法解析它们表达的相关性和作用相关性。结果PH后0 h和6 h时,CEBPαmRNA的比值为4.88±0.78和1.12±0.27,miR-144-3p为1.30±0.11和2.97±0.81,rno-LOC100365958_0001为6.99±0.55和0.16±0.05,rnoUsp3_0010为8.48±0.67和0.13±0.01,rno-AC241873_0010为11.85±0.93和0.09±0.02。CEBPα促进的G_(0)期相关基因细胞周期蛋白依赖性激酶2相关蛋白2(CDK2AP2)为2.55±0.42和0.74±0.11,G_(0)/G_(1)开关2(G_(0)S2)为3.85±0.23和0.64±0.08,信号转导子和转录激活因子1(STAT1)为2.57±0.13和1.32±0.13,转化生长因子β受体2(TGFBR2)为2.77±0.20和0.79±0.13,抑制的G_(0)期相关基因细胞周期蛋白依赖性激酸酶抑制剂1a(CDKN1a)为0.39±0.07和0.93±0.15。CEBPα促进的G_(1)期相关基因细胞周期蛋白G2(CCNG2)为1.19±0.09和0.25±0.06,抑制的G_(1)期相关基因ETS变异转录因子6(ETV6)为0.77±0.05和2.22±0.68,血红蛋白加氧酶1(HMOX1)为1.05±0.21和4.57±0.88,MAPK14为1.01±0.15和2.01±0.32,STAT3为0.74±0.15和2.88±0.24,肿瘤坏死因子(TNF)为0.80±0.14和2.29±0.51。结论PH后0 h时,CEBPαmRNA上调,有利于CEBPα促进的G_(0)期相关基因表达和肝细胞处于G_(0)期。相反,PH后6 h时,rno-LOC100365958_0001、rno-Usp3_0010、rno-AC241873_0010和miR-144-3p的相互作用加强了后者对CEBPαmRNA的抑制,不利于CEBPα形成,有利于CEBPα抑制的G_(1)期相关基因表达和肝细胞处于G_(1)期。

水稻RNA结合蛋白C3H12与RNA结合位点的鉴定

CCCH型锌指蛋白质C3H12是进化上保守的RNA结合蛋白质,它含有5个串联的CCCH锌指结构域ZnF1-5,形成2个紧密的锌指簇ZnF1-3和ZnF4-5。早期的研究发现,C3H12可能通过与mRNA结合的方式在转录后水平调控基因的表达。然而,与C3H12结合的mRNA类型和他们的结合模式,并未通过实验得到证明。本文表达纯化了一系列C3H12截短及全长蛋白质,并合成了一些潜在RNA底物ARE9、ARE19及对照Random21。通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)确定了C3H12与富含腺嘌呤尿嘧啶单元(AU-rich element,ARE)mRNA底物的结合,并揭示了互作核心区域和热力学性质。通过荧光光谱分析和微型热泳动(microscale thermophoresis,MST)技术对ITC的结果进一步佐证。结果表明:(1)C3H12与ARE底物的相互作用是焓驱动的能量有利的(ΔG<0)特异性结合,结合比为1:1。(2)C3H12与ARE19的亲和力较ARE9更高(约2倍)。(3)C3H12中ZnF1-3在与ARE类底物的结合活性中发挥主导作用。(4)C3H12结构中的141个氨基酸残基的接头不直接参与和ARE底物的相互作用。本研究揭示的CCCH型锌指蛋白质C3H12与ARE底物结合模式,将为进一步在分子结构水平阐明C3H12与ARE底物结合的机制奠定基础。