改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用

目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响。方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达。结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响。结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系。

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。

竞争性RT-PCR法及对大肠杆菌acrA基因mRNA表达水平的定量研究

建立了用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922的acrA基因mRNA表达水平的定量竞争性RT-PCR(QC-RT-PCR)体系。PCR合成目标片段的突变型片段(321bp)作为内标准模板(Internal standard,IS),与目标片段一致的片段(389bp)作为目标模板(Target standard,TS),优化两种模板共扩增体系;梯度稀释IS与等量大肠杆菌cDNA样本共扩增,扫描电泳条带,软件分析数据。结果表明,引物设计合适,以IS和TS为模板实现共扩增,产物(321bp和389bp)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳有效分离;梯度稀释IS与cDNA共扩增产物出现亮度梯度电泳条带;获得一元回归曲线y=-0.345+0.097x(相关系数r=0.959,标准差s=0.05997)。该研究成功构建内标准模板,优化的共扩增PCR体系实现了对大肠杆菌ATCC25922中acrA基因mRNA表达水平的检测,具有简便、高效、敏感度高等优点。

竞争性RT-PCR检测哮喘患者IL-8表达水平

利用反向ＰＣＲ法，缺失人ＩＬ－８ｃＤＮＡ内部ｂｐ序列，构建得到ＩＬ－８突变内标分子．用 已知量的该内标分子，通过竞争性ＲＴ－ＰＣＲ法、检测支气管哮喘患者外周血ＩＬ－８基因的表达情 况，发现患者ＩＬ－８ｍＲＮＡ的表达水平明显高于正常人对照组．这一结果初步表明，利用竞争 性ＲＴ－ＰＣＲ技术对支气管哮喘息者进行早期基因诊断，具有一定的可行性。

竞争性RT-PCR法定量分析骨巨细胞瘤中TGFβ-1 mRNA的表达水平

目的 用竞争性PCR法检测骨巨细胞瘤（GCT）中TGFβ- 1mRNA，分析其对肿瘤预后的意义。方法 通过RT- PCR法制备内标和外标，将等量的内标和等比稀释的外标进行竞争性共扩增，得到标准曲线，然后将等量的内标和cDNA标本共扩增，通过标准曲线求出标本中TGFβ- 1mRNA的水平，并与GCT分级进行对比。结果 内标和外标在共扩增中表现出很强的竞争性。GCT中TGFβ- 1 mRNA的表达水平随着肿瘤分级的上升明显增加，局部复发和肺转移的标本中TGFβ- 1mRNA表达水平较未复发的标本高。结论 竞争性RT- PCR是一种灵敏，简便、快速检测GCT中TGFβ- 1mRNA表达水平的方法。应用该方法和肿瘤病理分级标准来综合判断肿瘤的预后，有着重要的临床意义。

用于竞争性RT-PCR评估刚地弓形虫速殖子-缓殖子相互转换的多竞争体的构建与验证

刚地弓形虫感染中间宿主后几乎可以在所有组织内以速殖子形式快速增殖。宿主免疫功能正常时,宿主产生免疫力后,速殖子转变为缓殖子,在寄居部位形成包囊结构,长期存活。当宿主免疫功能降低时,包囊中缓殖子转变为速殖子,使疾病状态再现。

定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

多特异性内参照模板的构建及应用

目的构建多特异性内参照模板,用于Fas、FasL、GB、P、TIA1和βactin的竞争性PCR定量。方法体外合成DNA单链,PCR扩增后,得到2个片段。片段1长145bp,含有Fas、FasL、GB、P、TIA1和βactin的5′引物序列;片段2长147bp,含有相同基因的3′引物序列。将片段1、2分别克隆在载体PKF3上。结果克隆载体经酶切鉴定及DNA序列测定,证实为本实验所设计的多特异性内参照模板,以此为模板,用不同的引物进行PCR扩增,即可得到相应的竞争内参照。应用多特异性内参照模板对移植肾急性排斥患者外周血淋巴细胞中TIA1进行定量,结果显示,底物量在一定范围内,靶序列和竞争性内参照模板的扩增效率基本一致,尤其是在指数期。这一结果同样适用于Fas、FasL、GB、P和βactin的定量。结论本实验构建的多特异性内参照模板可用于6种基因的竞争性PCR检测,为进一步研究打下了基础。

光照对中枢和外周组织生物钟Clock基因表达的影响

[目的]分析光照对中枢和外周组织生物钟Clock基因mRNA表达的影响。[方法]采用竞争性RT_PCR法测定不同光照条件下中枢和外周组织中Clock基因的昼夜表达规律。[结果]发现Clock基因mRNA不仅在中枢 (下丘脑视交叉上核 ,SCN) ,而且在外周 (淋巴细胞 )均具有昼夜节律性表达。在光照 -黑暗交替光制下 ,中枢和外周Clock基因的表达几乎呈反相关系 ;在全黑暗条件下 ,Clock基因mRNA的表达存在昼夜节律 ,中枢和外周的Clock基因mRMA表达的峰值相位存在约8h的相位差。[结论]Clock基因的昼夜节律表达具内源性特征 ;

脂多糖诱导内脏器官白细胞介素15mRNA的表达

目的白细胞介素15(interleukin-15,IL-15)与炎症反应的关系。方法在含兔IL-15全长编码cDNA的质粒上缺失了部份片段,构建成竞争性RT-PCR的竞争子(competitor)。研究炎症反应后IL-15基因的转录情况。结果竞争性RT-PCR结果显示,IL-15与炎症反应密切相关,且脂多糖(LPS)增加了兔子内脏器官(心脏,肺,肾脏,脾脏和肝脏)中IL-15mRNA的表达。结论LPS可以增强IL-15的免疫反应。