基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定桃中氰戊菊酯的残留量

采用包被抗体、酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定了氰戊菊酯在桃中的残留量。结果表明：在氰戊菊酯多克隆抗体包被浓度为4．0mg／L、辣根过氧化物酶（HRP）标记氰戊菊酯半抗原稀释1．0×10^5倍条件下，ELISA法检测氰戊菊酯的线性浓度范围为0．01-10mg／L，氰戊菊酯对抗体．酶标半抗原反应的抑制中浓度（IC50）为193μg／L，相对标准偏差（RSD，n=5）为4．5％，IC20为13．5μg／L。在2、0．2和0．05mg／kg添加水平下，ELISA法测定桃中氰戊菊酯的回收率分别为81％-89％、85％～98％和85％-106％，RSD（n=5）分别为5．1％、5．6％和7．7％。ELISA法对桃中氰戊菊酯的最低检出浓度为0．014mg／kg。

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定甘蔗中的克百威残留

采用包被抗体直接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定了甘蔗中的克百威残留量。在优化条件下,对克百威标样检测的线性范围为0.0001～1mg/L,抑制中浓度(IC50)=3.09μg/L,5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为9.3%,IC20值为0.085μg/L。甘蔗中分别添加克百威标样1,0.1,0.01mg/kg,直接竞争ELISA法测定的回收率分别为86.3%～99.1%,89.0%～101%和70.7%～90.6%,RSD(n=5)分别为5.4%,5.2%和10.7%。ELISA法对甘蔗中克百威残留的最小检出量为6.3×10-11g,定量限可达1.26μg/kg。而同样前处理条件下高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法对克百威的最小检出量为5×10-8g,检测甘蔗中克百威残留的定量限仅为2.5mg/kg。

操作时差对竞争酶联免疫吸附试验法检测抗-HBc结果的影响

本研究采用操作时差对竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗-HBc结果影响的探讨,现将结果报告如下。 1材料与方法 1.1材料来源：66份血清标本随机采自2006年12月我院住院、门诊患者和健康体检者,干管抽静脉血3～5mL,37℃水浴箱放置15min后3000r／min离心15min，充分分离血清，-80℃低温冰箱冻存备检。

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

目的采用酶标抗原建立高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争酶联免疫吸附法(direct competitive enzyme linked immunosorbent assay,dc-ELISA)检测食品中三聚氰胺(melamine,MEL)残留。方法以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗原与标准品(或样品)中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系,以三聚氰胺标准品建立标准曲线进行定量。结果方法的IC_(50)为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9~35μg/L;检测样品的回收率在70%~120%之间,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论本方法灵敏度高、特异性强,可以满足实际样品的快速检测需求。

直接竞争酶联免疫吸附-高效液相色谱法测定烯效唑

应用本实验室制备的对烯效唑具特异性亲和力的多克降抗体,采用包被抗体直接竞争模式建立烯效唑的酶联免疫吸附分析法。在优化条件下,对烯效唑标样检测的线性范围为1～10^(-4)mg/L,线性中浓度为1.31μg/L,5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为8.4%;检出限为0.022μg/L。在苹果中分别添加烯效唑标样1 0,0.1和0 01 mg/kg;直接竞争E LISA法测定的回收率分别为84.6%～101.0%,99.6%～117 0%和80.8%～92.8%;RSD(n=5)分别为8.6%,6.9%和6.7%。ELISA法对苹果中烯效唑的检出限为0.024μg/kg。在同样前处理条件下,高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UVD)法对苹果中烯效唑的检出限为0.25 mg/kg,苹果中添加1 00 mg/kg烯效唑,HPLC UVD法测定的回收率为92.6%。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定氰戊菊酯

采用活性酯法,将氰戊菊酯半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-4-氨基丁酸与载体蛋白共价偶联合成突出氰戊菊酯分子结构特征的人工抗原和包被原。以人工抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,采用(NH4)2SO4分步盐析和DEAE纤维素柱层析法从抗血清中分离纯化对氰戊菊酯具特异性亲和力的抗体,采用活性酯法,以辣根过氧化物酶标记半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-6-氨基己酸。采用固定抗体、氰戊菊酯和酶标半抗原直接竞争结合固相抗体的模式,建立对氰戊菊酯具高特异性的酶联免疫吸附分析方法。在优化条件下,测定氰戊菊酯标样检测的线性浓度范围为0.001～10.0mg/L;检出限0.001mg/L;相对标准偏差(RSD,n=5)为9.19%。小白菜中分别添加0.10和5.0mg/kg氰戊菊酯,直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定,重复6次,回收率分别为83.8%～109%和93.6%～110%;RSD分别为11.7%和7.25%。对实际样品的有效检出限为0.007mg/L。其它常用拟除虫菊酯类杀虫剂(氯氰菊酯、溴氰菊脂、功夫菊酯、醚菊酯、联苯菊酯)不干扰氰戊菊酯的测定。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定小白菜中溴氰菊酯的残留量

应用作者所在实验室自制的、对溴氰菊酯具有特异性亲和力的多克隆抗体和酶标半抗原,建立了包被抗体-酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法（DC-ELISA）。小白菜样品经超声提取、浓缩和10%甲醇定容后采用DC-ELISA法测定,并采用高效液相色谱法进行验证。结果表明：在抗体包被浓度为2.0 mg/L、辣根过氧化物酶（HRP）标记溴氰菊酯半抗原稀释2.0×105倍、包被介质为p H 7.2 PB、反应介质为含0.125 mol/L Na Cl p H 6.8 PB的优化条件下,DCELISA法检测溴氰菊酯的线性范围为0.10～10 mg/L,溴氰菊酯对抗体-酶标半抗原反应的抑制中浓度（IC50）为1.68 mg/L,相对标准偏差（RSD,n=5）为2.11%,IC10值为0.16 mg/L。在5、1和0.2 mg/kg 3个添加水平下,DC-ELISA法测定小白菜中溴氰菊酯的平均回收率分别为97%、106%和95%,RSD（n=5）分别为8.5%、8.1%和8.1%。高效液相色谱法同步测定小白菜中添加0.2 mg/kg溴氰菊酯的回收率为107%。本研究建立的DC-ELISA法可用于小白菜中溴氰菊酯含量的快速测定。

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphnia magna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8 000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbentassay)。结果表明:此方法检测灵敏度为24ng.mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg.mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0.25%、<0.25%、2.13%、10.19%、3.88%、3.56%、2.81%、3.93%、5.00%和2.75%,具较高的特异性。说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测。

直接竞争酶联免疫吸附法检测虾过敏蛋白

目的:建立酶标抗原的直接竞争酶联免疫吸附法(dcELISA)检测食品中虾过敏蛋白,为食品过敏诊断试剂的开发和应用提供理论基础。方法:提取虾主要过敏蛋白,免疫小鼠制备抗虾过敏蛋白多克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原,建立酶标抗原的dcELISA检测虾过敏蛋白。结果:所建立的dcELISA法最低检测限为3.94ng/mL,标准曲线在0.12～128.86ng/mL范围内线性良好,批内和批间变异系数分别为6.16%和2.73%,回收率为82%～98%。结论:该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为进一步研制检测虾过敏蛋白的ELISA试剂盒提供有效的方法。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

快速定量分析牛乳中α-乳白蛋白的竞争酶联免疫吸附法

建立一种灵敏度高和特异性好的直接竞争ELISA法来定性和定量检测牛乳中α-乳白蛋白（α-LA）.通过使用牛乳α-LA多次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并采用过碘酸钠氧化法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的α-LA,建立检测α-LA的直接竞争ELISA法.所制备的多克隆抗体特异性较高,无明显交叉反应,效价为1∶80 920.酶标抗原的标记率达66.67%.直接竞争ELISA法标准曲线相关系数为0.998 57,回收率在86.00%-117.50%之间,重复性高,变异系数〈5%.与国标电泳方法进行样品检测比较,结果显示该方法可有效地用于食品中α-LA的快速定性和定量检测.

自制便携式振荡装置/间接竞争酶联免疫吸附法在水库微囊藻毒素-LR快速应急监测中的应用

应用自制便携式振荡装置,运用间接竞争酶联免疫吸附法(icELISA)建立快速测定水中微囊藻毒素(MC)-LR的现场初筛方法。结果表明:(1)自制便携式振荡装置的检测结果与手工振荡不存在差异,可用自制便携式振荡装置替代手工来进行振荡孵育操作。(2)icELISA建立了快速测定MC-LR的现场监测方法,MC-LR的标准曲线线性关系较好(r=-0.997 0),满足定性定量分析的要求,检出限为0.03μg/L,测定下限为0.12μg/L,空白溶液与实际水样加标回收率为96.2%~113.0%,方法精密度、准确度均较好。

牛奶中替米考星间接竞争酶联免疫吸附检测法的建立

本研究通过棋盘法优化替米考星抗体、包被原浓度,并考察了最佳包被条件,最佳反应温度、时间和酶标二抗最佳反应时间等,建立了替米考星残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）并应用到牛奶样本的检测。建立的间接竞争ELISA方法半数抑制浓度（IC50）为2.1ng/mL,牛奶中替米考星的最低检测限（LOD）为2μg/L。在5、10和20μg/L添加浓度下,回收率为79.2%-90.1%,变异系数不高于9.0%。与其他常见的大环内酯类药物无交叉反应。本研究建立的替米考星间接竞争ELISA方法灵敏度达到了残留限量标准要求,为开发可用于牛奶中替米考星的快速检测试剂盒奠定基础。

玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

基于伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA),用于玉米中伏马毒素的初步筛查。该方法优化了抗原包被浓度和单抗体稀释倍数、抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。结果显示,线性检测范围为1.41~54.2ng/m L,最低检测限为24.5μg/kg,实测玉米样品加标回收率为89.36%~108.54%。交叉反应结果显示,与伏马毒素B2(fumonisin B2,FB2)交叉反应率为129.88%,与其他真菌毒素交叉反应均小于10%,该ic-ELISA方法可对玉米样品中的FB1与FB2总量进行初筛。

间接和直接竞争酶联免疫吸附法快速检测中药材中黄曲霉毒素B1的对比研究

该研究基于自制的抗原和抗体,对比研究了间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)和直接竞争酶联免疫吸附法(dc-ELISA)快速检测中药材黄芪、生姜、大枣和莲子中黄曲霉毒素B1(AFB1)残留,通过考察不同样品提取方法来降低不同药用部位中药的基质效应。通过优化AFB1与HRP的摩尔比例提高dc-ELISA方法灵敏度。该研究中,ic-ELISA和dc-ELISA的灵敏度(IC_(50))分别为0.046、0.023 ng·mL^(-1),检出限(LOD)分别为0.007、0.004 ng·mL^(-1),检测时间分别为3 h、50 min,样品回收率为62.96%~104.4%,RSD<10%。53份样品中检测到3份莲子阳性样品,检测结果采用LC-MS/MS进行确证。该研究建立的2种方法准确、快速、灵敏,可用于黄芪、生姜、大枣、莲子及其他中药中AFB1的快速筛查。通过对比分析2种检测方法的优势与不足,可为检测机构和企业应用提供参考,结合实际情况选择相应的检测方法。

利用竞争酶联免疫吸附法测定牛血清白蛋白鉴别掺假牛乳

利用竞争酶联免疫吸附法(cELISA)定量分析牛乳中的牛血清白蛋白,以建立一种检测掺假牛乳的通用方法。通过对添加不同成分掺假牛乳样品的检测,分析了竞争酶联免疫吸附法测定牛血清白蛋白的特异性;通过对稀释倍数不同的掺假牛乳样品进行测定,验证了竞争酶联免疫吸附法测定牛血清白蛋白的可行性。结果表明:该法在测定掺假牛乳时不受添加物的影响,只与牛乳稀释程度有关,因而该法用于掺假牛乳的检测具有广泛适用性。

检测T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法的研究

目的 本研究在自制T-2毒素酶标半抗原的基础上，结合市售抗T-2毒素单克隆抗体，建立了检测谷物中T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）。方法粮食样品经70％甲醇-水溶液提取，用滤纸过滤并稀释后。再用0．45μm滤器过滤净化，该滤液用于ELISA检测。结果本方法最低检出量为0．125ng／ml，添加70-280ng／g T-2毒素的大米样品和面粉样品的平均回收率分别为85～117．5％和98．1～102．5％。结论结果表明，该方法简化了粮样提取步骤。可用于谷物及加工产品中T-2毒素的检测。

应用竞争性酶联免疫吸附试验检测鸡产蛋下降综合症抗体

用鸡产蛋下降综合症(Egg Drop Syndrome-76,EDS-76)灭活油佐剂苗,免疫30周龄产蛋鸡,获取高免血清。提取特异性免疫球蛋白后,用辣根过氧化酶标记,制备成酶标抗体,建立了竞争性酶联免疫吸附试验。该法与血凝抑制试验的平行测定的比较结果为,前者的阳性检出率为71.8%,而后者为59.0%,所以前者明显地优于后者。而且该试验敏感性高,特异性强,具有快速、准确的优点,适用于大规模的检测和检疫。