生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

目的采用酶标抗原建立高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争酶联免疫吸附法(direct competitive enzyme linked immunosorbent assay,dc-ELISA)检测食品中三聚氰胺(melamine,MEL)残留。方法以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗原与标准品(或样品)中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系,以三聚氰胺标准品建立标准曲线进行定量。结果方法的IC_(50)为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9~35μg/L;检测样品的回收率在70%~120%之间,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论本方法灵敏度高、特异性强,可以满足实际样品的快速检测需求。

直接竞争酶联免疫吸附法检测虾过敏蛋白

目的:建立酶标抗原的直接竞争酶联免疫吸附法(dcELISA)检测食品中虾过敏蛋白,为食品过敏诊断试剂的开发和应用提供理论基础。方法:提取虾主要过敏蛋白,免疫小鼠制备抗虾过敏蛋白多克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原,建立酶标抗原的dcELISA检测虾过敏蛋白。结果:所建立的dcELISA法最低检测限为3.94ng/mL,标准曲线在0.12～128.86ng/mL范围内线性良好,批内和批间变异系数分别为6.16%和2.73%,回收率为82%～98%。结论:该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为进一步研制检测虾过敏蛋白的ELISA试剂盒提供有效的方法。

自制便携式振荡装置/间接竞争酶联免疫吸附法在水库微囊藻毒素-LR快速应急监测中的应用

应用自制便携式振荡装置,运用间接竞争酶联免疫吸附法(icELISA)建立快速测定水中微囊藻毒素(MC)-LR的现场初筛方法。结果表明:(1)自制便携式振荡装置的检测结果与手工振荡不存在差异,可用自制便携式振荡装置替代手工来进行振荡孵育操作。(2)icELISA建立了快速测定MC-LR的现场监测方法,MC-LR的标准曲线线性关系较好(r=-0.997 0),满足定性定量分析的要求,检出限为0.03μg/L,测定下限为0.12μg/L,空白溶液与实际水样加标回收率为96.2%~113.0%,方法精密度、准确度均较好。

间接和直接竞争酶联免疫吸附法快速检测中药材中黄曲霉毒素B1的对比研究

该研究基于自制的抗原和抗体,对比研究了间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)和直接竞争酶联免疫吸附法(dc-ELISA)快速检测中药材黄芪、生姜、大枣和莲子中黄曲霉毒素B1(AFB1)残留,通过考察不同样品提取方法来降低不同药用部位中药的基质效应。通过优化AFB1与HRP的摩尔比例提高dc-ELISA方法灵敏度。该研究中,ic-ELISA和dc-ELISA的灵敏度(IC_(50))分别为0.046、0.023 ng·mL^(-1),检出限(LOD)分别为0.007、0.004 ng·mL^(-1),检测时间分别为3 h、50 min,样品回收率为62.96%~104.4%,RSD<10%。53份样品中检测到3份莲子阳性样品,检测结果采用LC-MS/MS进行确证。该研究建立的2种方法准确、快速、灵敏,可用于黄芪、生姜、大枣、莲子及其他中药中AFB1的快速筛查。通过对比分析2种检测方法的优势与不足,可为检测机构和企业应用提供参考,结合实际情况选择相应的检测方法。

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphnia magna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8 000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbentassay)。结果表明:此方法检测灵敏度为24ng.mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg.mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0.25%、<0.25%、2.13%、10.19%、3.88%、3.56%、2.81%、3.93%、5.00%和2.75%,具较高的特异性。说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测。

玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

基于伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA),用于玉米中伏马毒素的初步筛查。该方法优化了抗原包被浓度和单抗体稀释倍数、抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。结果显示,线性检测范围为1.41~54.2ng/m L,最低检测限为24.5μg/kg,实测玉米样品加标回收率为89.36%~108.54%。交叉反应结果显示,与伏马毒素B2(fumonisin B2,FB2)交叉反应率为129.88%,与其他真菌毒素交叉反应均小于10%,该ic-ELISA方法可对玉米样品中的FB1与FB2总量进行初筛。

间接竞争酶联免疫吸附法快速筛检莲子中黄曲霉毒素B_1的污染水平

建立间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）快速筛检＂药食同源＂中药-莲子中黄曲霉毒素B1（AFB1）的污染水平,并采用超快速液相串联质谱（UFLC-MS/MS）进行结果确证.通过基质匹配,AFB1在0.171~7.25 μgL-1线性关系良好（R2 〉 0.978）,半数抑制浓度（IC50）为1.29 μgL-1,加样回收率为74.73% ~ 126.9%,RSD〈5%,检测限（IC10）为0.128 μgL-1.将ic-ELSIA法应用于20批莲子中AFB1的筛查,结果显示：于30 ℃,30%湿度条件下贮藏一年的1~15号样品中AFB1污染水平为1.19~115.3 μgkg-1,40%样品中AFB1含量超过限量标准（5 μgkg-1）;新购买的16~20号样品中AFB1污染率为40%.以上结果经液质联用技术确证,通过计算ic-ELISA和液质测定结果之间的皮尔森相关系数可知,二者测定结果的匹配度达0.997.建立的ic-ELISA分析方法操作简便、灵敏、结果准确,可用于莲子中AFB1的高通量现场快速检测.

灵芝酸A多克隆抗体制备及酶联免疫吸附测定法的建立

以牛血清白蛋白为载体,采用活化酯法合成灵芝酸A的偶联抗原作为免疫原,按照免疫程序接种试验兔,获得针对偶联抗原的多克隆抗体。对多克隆抗体的效价及靶向进行分析后,构建灵芝酸A的间接竞争酶联免疫吸附测定法。结果显示:多克隆抗体中存在靶向偶联抗原3个区域的独特型抗体,总效价为1∶78 125,其中抗灵芝酸A特异性抗体效价为1∶3 125。间接竞争酶联免疫吸附测定法的灵芝酸A检出限为0.3μg/L,半数抑制浓度为4.0μg/L,线性范围在0.6~27.3μg/L之间。样品测定批间变异系数低于10%,样品加标回收率在82.9%~118.6%之间,对22份灵芝粉剂产品的测定结果显示不同品牌产品中灵芝酸A含量的差异极显著,该法测定结果与高效液相色谱法的测定结果相比,相关系数为0.972。结果表明,间接竞争酶联免疫吸附法测定灵芝酸A可行,该方法能够为灵芝保健品市场中相关产品的质量监控提供一种辅助方案。

DPPs类有机磷农药宽谱酶联免疫吸附分析方法的建立

【目的】制备识别二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药(DPPs)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析法(ic-ELISA),为实现农产品有机磷农药残留快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸为半抗原,制备完全抗原。筛选免疫小鼠,制备稳定分泌可识别DPPs抗体的单克隆细胞株,筛选出抗原和抗体最佳工作浓度组合,建立该单抗的ic-ELISA标准曲线,并分析该单抗与6种DPPs的交叉反应率,评估ic-ELISA的广谱性。利用所得抗体与喹硫磷交叉反应最强的特性对采购的柑橘和鲜橙样品进行喹硫磷添加回收试验。【结果】成功合成识别DPPs的人工抗原,包括包被抗原DPPs-OVA和免疫抗原DPPs-BSA。通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、广谱性最强的单克隆细胞株5G_(8)。以0.5μg/mL包被抗原DPPs-OVA、1.0μg/mL抗体5G_(8)2D_(5)为最佳工作浓度组合,将细胞株筛选过程中抗体识别率较高的有机磷农药——对硫磷选定为抑制标准物,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC_(50))为41.78 ng/mL,检测范围(IC_(20)~IC_(80))为3.21~239.59 ng/mL;所建立的ic-ELISA与5种DPPs(蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷)均存在不同程度的交叉反应,其中以喹硫磷的交叉反应率最高,达19.79%。比较ic-ELISA和气相色谱法(GC)对柑橘和鲜橙样品中喹硫磷的添加回收结果发现,ic-ELISA的添加回收率为75.80%~116.12%,GC的添加回收率介于92.5%~115.00%,2种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA经GC交叉验证准确性较高,可用于快速检测农产品中的喹硫磷残留。

草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。

双酚A残留酶联免疫分析方法的研究及应用

为了建立双酚A残留的酶联免疫分析方法,采用碳化二亚胺法将半抗原双酚酸(BHPVA)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,制备免疫原BHPVA-OVA和包被原BHPVA-BSA。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明BHPVA与BSA和OVA的偶联比分别为12∶1和16∶1。BHPVA-OVA免疫新西兰大白兔获得抗双酚A的多克隆抗体,抗体ELISA效价为1∶1×107。基于该抗体建立双酚A间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法,其检测的线性范围为0.02-100ng·mL-1,线性回归方程y=9.0326 ln x+39.105,R2=0.9975,双酚A的检测限为IC10=0.04ng·mL-1。采用所建立的ciELISA方法均检测出8种塑料食品袋中的双酚A残留,迁移析出量分别从4.9到31mg·L-1,批内和批间变异系数均小于12.48%,说明本试验所建立ciELISA法可有效地用于塑料食品袋中的双酚A迁移量的测定,不仅具有高度的灵敏性,而且具有较好的稳定性。

酶联免疫法检测混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量

目的建立酶联免疫法测定混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量的分析方法。方法采用直接竞争酶联免疫吸附法对样品进行测定。样品经甲醇溶液提取,提取的抗原及黄曲霉毒素B_1标记物与微孔板上的黄曲霉毒素B_1特异性单克隆抗体竞争结合,洗涤除去未结合杂质。将底物加入孵育,产生蓝色产物,加入终止液终止反应蓝色产物变成黄色产物,450nm处测量吸光度。结果本方法在2h内完成混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量的测定。黄曲霉毒素B_1的加标浓度在1.0～20.0μg/kg之间时的回收率为76.5%～120.2%,方法定量限为1.00μg/kg。结论该方法快速、准确、灵敏,适合测定混合植物油中黄曲霉毒素B_1。

酶联免疫法检测食品中乳酸链球菌素

建立了酶联免疫吸附法来检测乳制品、肉制品和含乳饮料中的乳酸链球菌素含量。在抗乳酸链球菌素多克隆抗体的基础上,建立间接竞争酶联免疫吸附法。所建立的间接竞争ELISA方法的灵敏度为0.1μg/mL,标准曲线范围为0.1～62.5μg/mL,乳制品的检测限为1.0μg/mL,肉制品的检测限为0.5μg/g,样本的添加回收率范围在80%～120%之间,变异系数<20%。所建立的间接竞争ELISA方法及制备的相关试剂盒具备准确、快速、简便的优点,能够满足乳制品、肉制品和含乳饮料中乳酸链球菌素含量的检测要求。

竞争化学发光酶免疫测定技术检测盐酸克伦特罗

目的：建立一种检测盐酸克伦特罗（clenbuterol, CLB）的竞争化学发光酶免疫测定法（chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA）。方法基于CLB的竞争酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）,通过优化反应温度、反应时间和缓冲体系pH建立了CLB的CLEIA测定法。用CLB小鼠中毒模型评价CLEIA检测法对实际样本的检测效果,并将CLEIA与LC-MS法的相关性进行了比较。结果 CLEIA法测定CLB的检测范围为0.0433~42.5363μg/L,检测限为0.0178μg/L,变异系数小于10%,回收率为95%~110%,对莱克多巴胺和沙丁胺醇仅有极低的交叉反应性。所建立的 CLEIA 法与 LC-MS 法在检测实际样本时具有较高的相关性。结论本研究建立的CLEIA法操作简便,检测限、灵敏度、准确度、特异性均符合检测要求,可用于实际样品的检测。

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997)。批内变异系数(CV)为1.07%～5.53%,批间CV值为3.33%～11.92%,确定此方法精确度良好。利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8%～84.32%,小麦面筋67.3%～88.27%,饲料70.3%～85.9%,牛乳83.47%～89.76%,鸡蛋76.2%～87.29%。确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量。

检测大鼠尿金属硫蛋白竞争ELISA法的建立和初步应用

目的建立竞争酶联免疫吸附法（ELISA）用以检测大鼠尿金属硫蛋白（UMT）的含量。方法用标准MT抗原包被酶标板,加入待测样品或标准MT与包被MT竞争鼠抗MT抗体（一抗）。再加入生物素化抗大鼠IgG（二抗）与一抗进行反应,然后在二抗联与亲和素化辣根过氧化物酶使底物显色,根据吸光度值计算样品浓度。结果该方法在150～2.34μg/ml间线性关系良好（r=0.9899）;批内精密度为3.38%～6.43%,批间精密度为5.32%～9.38%;加标回收率为90.13%～96.40%;雄性和雌性大鼠UMT含量分别为17.74μg/mgCr和15.97μg/mgCr。结论该方法简便,灵敏,具有较好的精密度和准确度,可用于大鼠UMT的检测。正常大鼠尿中含有MT,但雄性和雌性大鼠之间UMT无明显差异。

成骨生长肽免疫检测方法的研究

目的:建立一种快速而准确的检测血清成骨生长肽浓度的方法。方法:制备具有较高效价的成骨生长肽抗体,通过竞争性酶联免疫吸附法及其改进方法建立检测成骨生长肽浓度的标准曲线。结果:亲和纯化的抗体比盐析抗体的标准曲线更好,改进的竞争性酶联免疫吸附法方法比普通的竞争性酶联免疫吸附法方法的检测灵敏度高一个数量级,可满足临床检测血清成骨生长肽浓度灵敏度的要求。结论:改进的竞争性酶联免疫吸附法可以为临床研究提供可靠而灵敏地检测血清成骨生长肽含量的方法。

脱二氧喹烯酮多克隆抗体的制备及其直接竞争ELISA检测方法的建立

利用脱二氧喹烯酮(DQCT)的酮基为活性基团,分别采用混合酸酐法和碳二亚胺法合成了其免疫原(DQCT-BSA)和包被原(DQCT-OVA),用过碘酸钠氧化法将DQCT-OVA与辣根过氧化物酶(HRP)偶联,制备了酶标抗原(DQCT-OVA-HRP)。用DQCT-BSA免疫Balb/C小鼠,获得了效价1∶128 000的抗DQCT的多克隆抗体。分别用间接竞争ELISA法和直接竞争ELISA法检测DQCT并比较,最终建立了直接竞争ELISA检测方法,其IC50为39.8μg.mL-1,检测范围为1.6～1258.9μg.mL-1。为后续实际样品中脱二氧喹烯酮的检测奠定了基础。

蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法的建立

目的:旨在建立一种检测蘑菇中鹅膏毒肽(Amanitin,AMA)的间接竞争酶联免疫吸附方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:通过EDC/NHS在α-鹅膏毒肽的羧基位置引入6-氨基己酸得到半抗原,并进一步与不同的载体蛋白偶联制备免疫原和包被原。之后,利用免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。基于所获得的抗体,并通过对包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭条件、酶标二抗工作浓度和孵育时间等条件的优化,建立了蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法,最后对所建立方法的灵敏度、添加回收率、批内及批间变异等参数进行了评价。结果:合成的半抗原分子量为1033.12,经MALDI-TOF鉴定免疫原的偶联比约为10.03。基于杂交瘤技术制备、筛选出鼠单克隆抗体13H4的IC50为1.91μg/L。基于所获得单克隆抗体,所建立蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA方法的检出限为0.88μg/kg,添加回收率为85.66%~113.05%,批内变异系数为5.35%~9.54%,批间变异系数小于15%。结论:本研究所建立的ic-ELISA方法准确度、精密度、灵敏度较高、性能稳定,为突发毒蘑菇中毒事件的毒原分析提供了一种简便、可靠的快速检测方法。