鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白,并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rg G包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)≥31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID_(50)),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rg G分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1∶320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID_(50)/0.1 m L;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR (q PCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。q PCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV g G蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。

直接竞争ELISA检测拟柱孢藻毒素的方法建立和评价

拟柱孢藻毒素(CYN)对人和动物具有高毒性而在世界上广受关注,快速检测方法的建立可为蓝藻毒素的风险评估提供有效的技术手段.本研究基于前期制备的CYN的单克隆抗体N8,旨在建立一种CYN的快速免疫检测方法-直接竞争ELISA.在对HRP-CYN酶标记物和N8单抗的稀释度进行优化后,最适反应条件下建立的直接竞争ELISA在0~200ng/mL CYN浓度下呈现典型的S型反应曲线,该方法的灵敏度为0.069ng/mL,经logit-log拟合的线性范围为0.1~10ng/mL,检出限远低于WHO建议的0.7ng/mL CYN的安全限值.本研究建立的ELISA方法对水库水样和小球藻稀释液中加标回收率分别为80.44%~125.4%和52.97%~155.19%,在测定CYN时与商业Beacon试剂盒的检测结果高度一致.对大沙河水库中CYN的监测表明该毒素在水体中常年存在,但未超过WHO建议的安全限值.本研究发展的ELISA可实现水样和藻样中CYN的快速检测,为供水安全保障提供一种新的技术手段.

固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的比较

为对比固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的应用,选择猪血清345份、牛血清110份、羊血清159份,共614份血清样品同时进行O型和A型抗体检测,对比两种检测方法的符合率和对不同畜种的检出率。结果:两种检测方法在O型抗体检测中的符合率为95.3%,在A型抗体检测中的符合率为96.1%,对不同畜种的检出率无明显差异。结论:在大规模检测免疫抗体时,推荐采样固相竞争ELISA检测方法。

大型溞ChE和NAGase间接竞争和非竞争ELISA方法的比较

[目的]探索间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法测定大型溞ChE和NAGase的试验条件及方法灵敏度。[方法]分别采用间接竞争和间接非竞争ELISA方法测定大型溞ChE和NAGase。[结果]对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.466μg/m L和1∶10 000,灵敏度为7.426 7 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.277μg/m L和1∶8 000,灵敏度为0.163 4 ng/m L。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为8.961μg/m L和1∶6 000,灵敏度为4.199 9 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.450μg/m L和1∶4 000,灵敏度为0.250 8 ng/m L。[结论]无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA,加之其操作简便,间接竞争ELISA在生物和环境样品ChE和NAGase含量检测中值得推广应用。

水体中微囊藻毒素-LR的间接竞争ELISA检测

在自制包被完全抗原浓度为5μg／mL、单克隆抗体工作稀释度为1：3000、酶标二抗鼠工作稀释度为1：3000、微囊藻毒素-LR浓度在0．001-30μg／L、显色底物为邻苯二胺，采用间接竞争酶联免疫吸附试验对水体中的微囊藻毒素-LR进行检测，结果表明，该方法与高效液相色谱的检测结果相关系数大于0．99，多次重复实验相对标准偏差小于10％，最低检测限能达到0．01μg／L。定量检测区间为0．01～3μg／L，该方法对[4-精氨酸]微囊藻毒素能特异性识别，对来自实际水样中的干扰有相当的耐受力．

单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用

以猪霍乱沙门氏菌作为包被抗原 ,利用沙门氏菌O7单克隆抗体酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪霍乱沙门氏菌抗体。经过研究确定抗原包被浓度为 2×1 0 8CFU/ml,血清检测稀释度为 1∶1 6,酶标抗体浓度为 1∶70 0 ,包被液为碳酸盐缓冲液 ( 0 .0 5MpH9.6)。应用单抗竞争ELISA和平板凝集试验 (PAT)同时对 5 0 6份血清进行猪霍乱抗体检测 ,PAT的检出率为 3 .60 % ,ELISA检出率为 5 .75 % ,两者符合率达 96.4%。试验结果表明 ,ELISA方法敏感性高 ,特异性强 ,稳定性和重复性好 ,操作简便。本方法的建立在猪群沙门氏菌感染的检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查方面具有应用价值。

牛乳过敏原β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

检测牛乳中的主要过敏原β-乳球蛋白,利用β-乳球蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛β-乳球蛋白的多克隆抗体,以β-乳球蛋白包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗、四甲基联苯胺（TMB）为底物,建立了牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争酶联免疫检测法（ELISA）。确定了包被抗原质量浓度为0.5μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶6 400,酶标二抗稀释度为1∶10 000。结果达到批内误差3.87%,批间误差6.51%;检测的线性范围为0.05～1.00μg/mL,标准曲线回归方程y=-1.930 2x-0.124 1,相关系数为0.994 5,说明所建立的方法灵敏度高,具有良好的准确性和重复性。

沙丁胺醇直接竞争ELISA法快速测定

建立沙丁胺醇的直接竞争ELISA(dcELISA)快速检测方法,采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体,棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数,通过单因素试验,考察反应体系中表面活性剂、离子浓度、甲醇体积分数、pH值因素对dcELISA性能的影响,确定最优检测条件,同时考察方法的特异性。结果表明:酶标抗体克分子比为2.1时偶合物的滴度最高,最佳反应条件为包被抗原质量浓度1μg/mL,酶标抗体稀释2560倍,0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐抗体稀释液(PBS)中含体积分数0.05%的Tween-20、0.5mol/LNaCl溶液和体积分数5%的甲醇时dcELISA具有最高的灵敏度和最好的稳定性,所建立方法的IC50为10.3ng/mL,检测限为0.049ng/mL,线性范围0.3～76.30ng/mL,批内变异系数13.8%,批间变异系数为22.38%,与克伦特罗交叉反应率为321.18%,与溴布特罗交差反应率为29.09%,与其他结构类似物没有明显交叉反应。本研究所建立的dcELISA可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测。

镉离子单克隆抗体的鉴定及竞争ELISA的建立

目的制备Cd2+单克隆抗体(McAbs,单抗),建立Cd2+间接竞争酶免疫学检测方法(ELISA)。方法利用双功能螯合剂iEDTA将Cd2+分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备免疫抗原和检测抗原。免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术制备抗Cd2+的单抗。鉴定单抗的效价、特异性、亚类及亲和力。以该抗体为基础建立检测镉离子的间接竞争ELISA方法,分析该方法的灵敏度、检测限、工作范围。结果成功制备出Cd-iEDTA-KLH和Cd-iEDTA-BSA偶联物;筛选出一株稳定分泌抗Cd-iEDTA单抗的杂交瘤细胞株C2C5,该细胞株分泌的抗体亚类为IgG1,腹水抗体效价为1×106,相对亲和力结合常数Ka为1.6×109L/mol。特异性结果显示,除Hg2+外,该抗体与Pb2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Ca2+、Cu2+等金属离子的交叉反应低。建立了检测镉离子的间接竞争ELISA方法,该方法的检测限为10ng/mL,IC50为250ng/mL。结论建立了镉离子的竞争ELISA检测方法,检测限达到无公害水产品的国家标准(100ng/g)。

河豚毒素直接竞争ELISA检测方法的研究

本研究应用直接竞争ELISA法对河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）进行快速检测。用过碘酸钠氧化法合成酶标记抗原（HRP-OVA-TFX），用直接ELISA方法对合成的酶标记抗原进行鉴定表明其与抗TTX单克隆抗体具有特异性反应。在比基础上建立了包被单抗的直接竞争ELISA方法。该方法对TTX的检测限可达到1.1μg／L，IC50为20.4μg／L，线性范围3.3-137μg／L，批内变异系数小于6.25％，批间变异系数小于7.34%。对鲫鱼的肌肉组织添加TTX标准品，回收率为65％-93.2％，变异系数为9.41％-12.77％。

直接竞争ELISA法快速测定水产品中6种氟喹诺酮类药物

采用过碘酸钠法将抗环丙沙星单克隆抗体（MAb-CIP）与辣根过氧化物酶（HRP）偶联制备酶标抗体MAbCIP-HRP,建立了检测水产品中6种氟喹诺酮类药物残留的直接竞争酶联免疫吸附分析方法（dcELISA）,考察了包被原浓度、竞争反应时间和有机溶剂等因素对方法灵敏度的影响。结果表明：在优化的反应条件下,所建立的dcELISA针对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和双氟沙星6种氟喹诺酮类药物的检测限（LOD）均不超过0.5ng/mL,线性范围（IC20-IC80）在1.0-12.1ng/mL之间;对虾、鳗鲡和鲫鱼三种水产样品中添加5.0、10.0和20μg/kg时,加标回收率为70.4%-104.1%,相对标准偏差为5.0%~14.7%;本方法可用于水产品中氟喹诺酮类（FQs）药物多残留的快速测定。

直接竞争ELISA检测大米样品中的重金属镉

目的直接竞争ELISA方法检测大米样品中重金属镉。方法用纳米Ti O2对微波消解处理的大米样品中的重金属镉进行富集,通过比较不同p H值和不同洗脱体积来优化纳米Ti O2富集方法,再用直接竞争ELISA检测重金属镉的含量。结果在p H为9时,纳米Ti O2对重金属镉有良好的吸附性,20 mg/ml的EDTA·2Na可将纳米Ti O2吸附的镉定量洗脱。用纯化后的镉单克隆抗体建立直接竞争ELISA检测方法,并进行灵敏度和特异性分析,其灵敏度（IC50）为19 ng/ml,检测限（IC10）为2.1 ng/ml,检测范围（IC20~IC80）为3.6~98.2 ng/ml。用优化后的直接竞争ELISA对富集洗脱后的镉溶液进行检测,检测效果满足国家检测标准。结论本研究对6份市售大米样品采用微波消解和富集,通过直接竞争ELISA检测其镉含量,所得结果与仪器法测定结果一致,可用于实际样品的快速检测。

O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

本研究建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法,确立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型口蹄疫血清阴阳性判定标准:抗体效价大于或等于1∶32时判为O型口蹄疫抗体阳性;1∶16～1∶32时判为O型口蹄疫抗体可疑。检测131份阴性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和A型阳性血清,固相竞争ELISA方法和液相阻断ELISA方法的特异性分别是95.5%,84.7%。固相竞争ELISA方法检测口蹄疫亚洲1型、口蹄疫A型阳性血清时,无交叉反应,O型口蹄疫病毒感染牛、免疫牛和感染猪血清的阳性检出率均为100%,免疫猪检出率为86.7%。

直接竞争ELISA检测氯霉素残留的方法建立及初步应用

用混合酸酐法合成氯霉素的CAP抗原,用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记抗原,用ELISA方法对合成的CAP抗原、CAP酶标记抗原进行鉴定表明其与抗CAP单克隆抗体具有特异性反应。在此基础上建立了包被二抗的直接竞争ELISA方法。特异性试验结果表明,CAP琥珀酸酯、CAP琥珀酸钠盐的交叉反应率分别为107%、106.4%;甲砜霉素、氟甲砜霉素与CAP的交叉反应率小于0.016%;与其他结构类似物间未见交叉反应。该方法对CAP的检测限可达到0.1μg/L,IC50为11.6μg/L,线性范围0.1～100μg/L,批内变异系数小于11.5%,批间变异系数小于19.6%。对猪肉、鸡肉、蜂蜜分别添加1.0、3.0、10.0、30.0μg/L CAP标准品,回收率61.0%～102.0%,变异系数为6.6%～15.8%;对猪肉、鸡肉、蜂蜜中CAP的最低检测限分别为0.48、0.42、1.20μg/kg。

除草剂丁草胺直接竞争ELISA检测方法研究

制备出3种不同结合比的酶标抗体,对检测条件进行了优化,建立了标记抗体固相抗原直接竞争ELISA(cdELISA)检测丁草胺的方法。结果表明,酶标抗体克分子比为1.55时偶合物活性最高,包被浓度1μg·mL-1,酶标抗体800倍稀释,稀释液采用2×PBS,不含BSA、甲醇,建立的标准曲线IC50=1.7ng·mL-1,检测限为0.006ng·mL-1,检测范围0.06～2616.7ng·mL-1,批内变系数9.25%,批间变异系数23.55%。蒸馏水以及稀释10倍后的矿泉水、池塘水、稻田水添加1ng·mL-1和10ng·mL-1的丁草胺,用所建立的方法检测,平均回收率分别为93.27%、158.50%、119.75%、124.51%。本研究为进一步开发丁草胺免疫分析试剂盒奠定了基础。

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争ELISA检测方法的建立

以金黄色葡萄球菌B型肠毒素免疫Balb/c小鼠,待血清效价达到要求后,腹腔注射骨髓瘤细胞,制备抗金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗体,并建立快速检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素的间接竞争ELISA(ciELISA)方法。经方阵滴定确定B型肠毒素的最佳包被浓度为0.31μg/ml,抗B型肠毒素抗体的稀释度为1:1.2×104,羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1:103。本实验建立的B型肠毒素的间接竞争ELISA检测方法的最低检测量为1ng/ml,线性检测范围为1～103ng/ml,相关系数R2=0.9951,人工污染样品的平均回收率为94.5%。

中山病多克隆抗体竞争ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速的中山病血清抗体监测方法,本研究采用纯化的中山病病毒(CHUV)包被ELISA反应板,兔抗CHUV多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测CHUV抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为4.12μg/m L,竞争抗体最佳使用浓度为1∶12 000倍。特异性试验显示该C-ELISA方法仅能检测CHUV抗体,其它相关病毒阳性血清检测结果均为阴性。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究建立的C-ELISA方法敏感性高于血清中和试验和琼脂扩散试验。分别用C-ELISA、RT-PCR和病毒分离试验对监控动物每周采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其它两种方法检测结果对应一致。本研究建立的C-ELISA为CHUV抗体的检测提供了一种快速、方便、可靠的方法。

竞争ELISA检测猪呼吸与繁殖综合征病毒抗体研究

应用抗PRRSN蛋的单克隆抗体建立了竞争ELISA检测技术,与美国IDEXX公司的间接ELISA检测试剂盒对比检测了30份SPF猪血清,29头SPF猪人工接种呼吸与繁殖综合征病毒后于5d、12d、29d采集的猪血清共87份,临床血清95份,以及其他相关病毒的阳性血清。实验证明,竞争ELISA的检测阴阳性限值为30%,检测特异性为100%,在人工攻PRRSV病毒第五天的猪血清中,可检测到抗PRRSVN蛋白抗体,12dpi,阳性检出率为93%,29dpi,阳性检出率为100%,与IDEXXPRRSVELISA试剂盒进行比对,结果表明,二种检测方法检测美洲株PRRSV抗体的符合率为90%以上,但检测欧洲株抗体符合率较低。建立的竞争ELISA检测技术对于PRRSV美洲株抗体的早期诊断有非常重要的意义。