应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响

根据牛肝细胞内PC(丙酮酸羧化酶)基因组与PCcDNA相比多含有一个内含子序列,在其中再插入一外源DNA序列,从而使最终构建的突变体片段的长度大于PCcDNA的长度,成功构建了PCcDNA的竞争DNA模板,然后应用竞争PCR方法研究了丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0、1.5、2.5、3.5、4.5、8.5、11.5mmol/L,处理24h,提取总RNA、逆转录,在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明,随着丙酸钠浓度的升高,PCmRNA水平呈上升趋势,提示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。

鹅圆环病毒竞争PCR检测方法的建立

建立了基层临床定量检测鹅圆环病毒DNA的竞争PCR方法。以含有鹅圆环病毒(GoCV)全长基因组的pMDT-GoCV-yk01质粒为模板,PCR扩增出长度为625 bp的片段,克隆到pGEM-T Easy载体,获得目标模板,命名为pGoCV625-T;同时,构建与目标模板DNA有相同引物结合区、扩增片段长度为300 bp的竞争模板,克隆于pMD18-T,获得竞争模板,命名为pGoCV300-T。用定量竞争模板pGoCV300-T与系列倍比稀释的定量目标模板pGoCV625-T进行竞争PCR扩增,利用二者PCR产物的荧光强度(IOD)比值与目标模板浓度对数值间的关联性建立标准竞争曲线,推算出直线回归方程,建立GoCV竞争PCR方法。结果表明,竞争模板与目标模板共扩增的最低检测限为1.0μl1.0×104拷贝。初步应用试验结果表明,该方法可定量检测GoCV阳性鹅法氏囊组织中的GoCV DNA。

竞争PCR定量检测免疫小鼠细胞因子表达水平

目的 :利用竞争PCR技术定量检测各种细胞因子的表达水平。方法 :在机体免疫应答过程中 ,细胞因子作为免疫调节分子在免疫网络系统中发挥重要的调节功能 ,T细胞能够通过产生并分泌各种细胞因子来调节机体的免疫反应。本研究采用竞争PCR技术 ,通过提取的小鼠脾脏组织总RNA ,经反转录得到cDNA ,利用一种修饰的竞争模板pQRS进行竞争PCR扩增 ,然后利用琼脂糖凝胶电泳分析并与竞争模板产物比较而定量。结论 :结果表明竞争PCR能够初步定量免疫前后小鼠脾脏组织表达的IL- 2、IL - 4、IL - 10、IL - 12和IFN -γ的表达量。为深入研究免疫前后小鼠体内各种细胞因子的动态水平和分析细胞免疫水平奠定了基础。

竞争PCR-微流芯片法检测血清HBV-DNA含量

目的评价微流芯片法检测乙型肝炎病毒(HBV)基因的竞争PCR扩增产物含量的准确性。方法通过竞争PCR-微流芯片法的重复性试验、稀释试验及与竞争PCR-微孔板杂交法、荧光PCR法的比较,判断HBV-DNA检测的准确性。结果竞争PCR-微流芯片法重复性、稀释试验的线性相关性较好;检测线性范围高于竞争PCR-微孔板杂交法,竞争PCR内对照的含量对检测结果有一定影响;与荧光PCR法检测有较好的一致性。结论竞争PCR-微流芯片法是临床检测HBV-DNA含量可行的一种方法。

一种快速检测植物病毒RNA蓄积量的竞争PCR方法

用Oligo6.6软件在pUC18上设计1对比目的基因多100-200bp的内参引物，摸索了目的基因和内参共同扩增的竞争PCR反应条件，测定了嘧肽霉素处理对烟草组织中烟草花叶病毒RNA相对含量的影响，同时用间接ELISA方法验证了该方法。试验结果表明：竞争PER的方法能够快速、相对准确的测定植物组织中病毒RNA蓄积量的变化情况。

应用竞争PCR方法检测亚硝化细菌的研究

选用竞争PCR技术建立了亚硝化细菌的快速定量检测方法。实验以实验室分离、鉴定的一株亚硝化细菌提取的DNA为模板,设计特异性引物,制备特异性内标模板,进行竞争PCR实验;同时采用传统的平板计数法和吖啶橙荧光显微镜计数法两种方法进行细菌计数,与竞争PCR结果比较分析,建立了样品细菌数量与内标模板量的线性方程,并将其应用于海水养殖环境中亚硝化细菌的检测中。该方法具有简化检测过程、缩短细菌检测时间、无须昂贵仪器设备等优点,并克服有些环境微生物难以培养的困难,为将来有益菌在应用中实际存活和繁殖情况的监测提供了有力的技术支撑。

竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA

目的 研究竞争性 PCR及其产物酶联杂交定量检测法价值。方法 竞争性 PCR对 HBV基因进行扩增 ,并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。结果 检测 HBV DNA灵敏度、特异性及定量分析精确度均十分理想。

用竞争PCR方法定量检测猪MHC-DM mRNA

根据GenBank中猪MHC-DM基因序列,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪DM基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了其缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了猪DM标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简便,特异性和敏感性高,可用于猪DM mRNA水平的定量检测。

竞争PCR用于乙肝病毒DNA定量检测初探

目的 评估竞争PCR这种检测方法的临床有效性。方法 用竞争PCR和荧光定量PCR两种方法对同一组患者血清HBVDNA进行了定量检测。竞争PCR是通过聚合酶链反应过程中竞争子和目的乙肝病毒DNA竞争同一反应管内的同一引物 ,通过凝胶成像比较目的乙肝病毒DNA和已知量竞争子的亮度 ,推测出目的DNA的含量。再将其结果与荧光定量PCR的结果相比较。结果 竞争PCR与荧光定量PCR检测的结果一致。结论 运用竞争PCR的方法对乙肝病毒DNA进行定量检测结果精确、成本较低 ,简便快速、易于操作 ,可推广使用。

采用定量竞争PCR技术定量分析猪DNA

当今的许多肉产品都可能由几种动物的肉按照不同比例组成。为保证消费者不受欺骗 ,有必要对复合食物产品的成分同时进行定性和定量监测。多聚链式聚合反应 (PCR)等以 DNA为基础的技术被广泛应用于种类鉴定 ,但利用当前的技术不能测出某种特定成分的比例。本研究报道了一种用于猪 DNA检测和定量分析的定量竞争多聚链式聚合反应技术 (QC-PCR的开发和评定 ,该技术采用一种以生长激素基因 sus scrofa为基础的新型猪特异性 PCR系统。构建一个与猪的目标序列在长度上仅差 3 0 bp的 DNA竞争物 ,与目标序列一起用于 PCR。用来自牛、羊、肉鸡和火鸡的 DNA对这个新引物的特异性进行了评价。通过含有猪 DNA和相应数量牛 DNA的混合物的共同扩增使竞争物的浓度调到猪 DNA含量的2 %或 2 0 %。

用定量竞争PCR检测和定量IBDV cDNA与RNA

最近,美国研究人员研制了一种定量竞争PCR。用这种方法可以测定传染性囊病病毒(IBDV)的互补DNA(cDNA)和RNA水平,并且可以用竞争PCR(QC-PCR)扩增达到定量的水平。将竞争者一个野生型IBDV cDNA的缺失突变型做连续10倍稀释,将病毒RNA逆转录后用IBDV cDNA进行协同扩增。用琼脂糖凝胶电泳、染色和光密度扫描后。

应用竞争PCR定量检测猪IFN-γ mRNA

运用 RT- PCR从经 Con A体外刺激培养的猪外周血单核细胞 (PBMC)提取的细胞总 RNA中扩增猪 γ-干扰素(IFN-γ)的部分片段 ,经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段 ,将余下的 2个较大片段连接 ,并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物 ,从而获得截短的同源性片段。将其纯化后克隆于 p MD1 8- T载体 ,重组质粒经酶切和 PCR鉴定后进行序列测定 ,验证无误后作为竞争性模板内对照 ,一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的 PBMC总 RNA反转录产物进行 PCR,产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭 (EB)嵌入光密度值 (IOD) ,经校正后取上述两者比值的对数值作为 Y轴 ,取已知竞争模板相应浓度的对数值作为 X轴 ,绘制成竞争曲线。应用建立的竞争 PCR对不同样品重复试验表明 ,本方法操作简单 ,结果可靠 ,稳定性高 ,适用于猪 IFN-γ m

竞争RT-PCR法定量检测多药耐药基因的表达

由ＭＤＲ１过度表达所介导的多药耐药性存在于多种肿瘤组织中，是降低化疗效果的主要原因之一，其耐受化疗药物的程度与ＭＤＲ１的表达量呈正相关．准确测定ＭＤＲ１的表达量在临床化疗过程中有重要的指导意义．建立了竞争ＲＴＰＣＲ定量检测ＭＤＲ１表达的方法．首先构建含ＭＤＲ１ｃＤＮＡ片段的质粒，其携带的ｃＤＮＡ和靶ｃＤＮＡ有相同的引物结合区，但和靶ｃＤＮＡ长度上有区别（少５８ｂｐ）．把该ｃＤＮＡ在体外转录出的ｃＲＮＡ作为竞争ＰＣＲ的内参照，该ｃＲＮＡ与靶ＲＮＡ在同一体系内进行反转录和ＰＣＲ过程，二者的ＰＣＲ产物因长度不同可经电泳区分开．分析电泳结果，由已知的ｃＲＮＡ内参的量可计算出靶ＲＮＡ的量，从而得到ＭＤＲ１基因的绝对表达量．该方法具有灵敏、可靠、准确等优点．

应用定量竞争RT-PCR筛选芳香烃受体基因RNA干扰片段

目的筛选对人气管上皮细胞株16HBE芳香烃受体基因mRNA表达有效抑制的特异RNAi片段。方法自行制备内参照为竞争模板,应用定量竞争RTPCR方法,分别检测转染有4个不同芳香烃受体基因RNA干扰位点的16HBE细胞芳香烃受体mRNA的表达,评价不同片段的RNA干扰效果。结果转染4种芳香烃受体基因RNA干扰片段的16HBE细胞的每40ng总RNA芳香烃受体基因mRNA平均表达量分别为5.65fg、14.78fg、3.14fg和0.68fg,mRNA表达平均抑制率分别为61.6%、-0.5%、78.6%和95.4%。结论应用定量竞争RTPCR准确地定量基因的mRNA表达水平,筛查出芳香烃受体基因RNA干扰有效序列,为进一步研究芳香烃受体基因的功能创造了条件。

竞争性PCR定量检测鸡传染性贫血病毒核酸

将删除33个碱基序列的CAVDNA克隆进质粒pSBII,提取质粒DNA,经过纯化、定量后作为竞争性模板,建立了一种定量检测鸡传染性贫血病毒核酸方法。该方法能够检测出的最低CAVDNA为103.5Molecules/μL,其精确度可达到100.5Molecules/μL。该方法与传统方法相比,具有节省时间、节约试剂和受其它因素干扰小等特点。

竞争性RT-PCR测定法及BMP-2mRNA的定量检测

建立竞争性 PCR方法 ,以期用于转录水平基因表达的定量研究 .以检测大鼠颅骨骨细胞总RNA中骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 ,bone morphogenetic protein- 2 ) m RNA含量为例 ,构建大鼠BMP- 2基因的竞争模板 ,以之为内对照进行竞争性 PCR.PCR反应结束后 ,电泳、拍照 ,扫描所扩增条带密度 ,作回归方程 .根据回归方程 ,计算出正常 7d Wistar大鼠颅骨总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量为 1 .1 2 5amol/μg RNA.结果显示 ,成功构建了大鼠 BMP- 2基因的竞争模板 ,建立了可以测定大鼠颅骨骨细胞总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量的竞争性 PCR方法 .

耐热菌的竞争定量PCR检测方法优化与建立

【目的】研究苹果浓缩汁中耐热菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)的定量PCR快速检测法。【方法】通过引物设计、PCR扩增及凝胶纯化试剂盒回收,构建并获得耐热菌的PCR竞争模板;用获得的竞争模板作为定量内标物建立耐热菌的竞争定量PCR(QC-PCR)检测体系。【结果】经对建立的QC-PCR检测体系优化,目标模板检测灵敏度由5×104个分子/PCR体系,提高到50个分子/PCR体系,竞争模板和目标模板分子共扩增可检测到5×102个目标模板分子/PCR体系,并能从人工回添苹果浓缩汁样品中定量检测到5×103cfu/PCR体系的耐热菌,整个检测时间为4～5h,比传统的细菌培养皿培养记数法时间(4～5d)大大缩短。【结论】本研究建立的耐热菌竞争定量PCR检测法特异、快速,可作为微生物PCR竞争模板构建和建立竞争定量PCR的方法学参考,也可用于商品果汁和苹果浓缩汁工业化生产中耐热菌的快速检测和质量安全控制。

宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法建立

利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法。实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体上,通过测序和序列比对,除两端引物序列完全相似外,其余部分没有同源性,因此可以作为定量检测的非同源模板。通过计算非同源模板的拷贝数,进行竞争定量PCR检测宿根矮化病,建立宿根矮化病菌的标准竞争曲线和直线回归方程。本研究建立的竞争定量PCR检测方法操作简单、特异性和敏感性高,适合于宿根矮化病菌的检测,并可为其它病菌竞争定量PCR检测方法的建立提供参考。

胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA同源模板竞争性PCR定量方法的建立

胰岛素样生长因子 1(IGF 1)是一种多功能的细胞增殖调控因子 ,其表达水平受多种因素的影响 ,为了研究IGF 1基因在转录水平上的调控机制 ,建立了定量测定IGF 1mRNA的竞争性PCR方法 .同时 ,也建立了一种简便的制备同源性竞争模板的方法 .以构建好的重组pUC IGF 1质粒为基础 ,利用IGF 1mRNA序列上唯一存在 ,但是在pUC18质粒上多拷贝的MspⅠ酶切位点 ,以该限制性内切酶处理重组pUC IGF 1质粒 .在T4DNA连接酶作用下对酶切产物进行随机连接 ,以连接产物作为模板 ,用可扩增IGF 1cDNA的引物进行PCR ,由此得到因含有随机插入序列而与原IGF 1cDNA产生明显长度差别的重组IGF 1.以不同浓度的该DNA片段作为同源竞争模板与大鼠肝组织cDNA在同一反应体系中进行PCR ,对PCR产物进行分析 ,计算出样本中IGF 1cDNA的初始浓度 .成功地建立了IGF 1mRNA的竞争性PCR定量检测方法 ,为研究IGF 1基因的表达调控奠定了基础 。