竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。

改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用

目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响。方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达。结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响。结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系。

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。

竞争性RT-PCR法及对大肠杆菌acrA基因mRNA表达水平的定量研究

建立了用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922的acrA基因mRNA表达水平的定量竞争性RT-PCR(QC-RT-PCR)体系。PCR合成目标片段的突变型片段(321bp)作为内标准模板(Internal standard,IS),与目标片段一致的片段(389bp)作为目标模板(Target standard,TS),优化两种模板共扩增体系;梯度稀释IS与等量大肠杆菌cDNA样本共扩增,扫描电泳条带,软件分析数据。结果表明,引物设计合适,以IS和TS为模板实现共扩增,产物(321bp和389bp)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳有效分离;梯度稀释IS与cDNA共扩增产物出现亮度梯度电泳条带;获得一元回归曲线y=-0.345+0.097x(相关系数r=0.959,标准差s=0.05997)。该研究成功构建内标准模板,优化的共扩增PCR体系实现了对大肠杆菌ATCC25922中acrA基因mRNA表达水平的检测,具有简便、高效、敏感度高等优点。

竞争性RT-PCR检测哮喘患者IL-8表达水平

利用反向ＰＣＲ法，缺失人ＩＬ－８ｃＤＮＡ内部ｂｐ序列，构建得到ＩＬ－８突变内标分子．用 已知量的该内标分子，通过竞争性ＲＴ－ＰＣＲ法、检测支气管哮喘患者外周血ＩＬ－８基因的表达情 况，发现患者ＩＬ－８ｍＲＮＡ的表达水平明显高于正常人对照组．这一结果初步表明，利用竞争 性ＲＴ－ＰＣＲ技术对支气管哮喘息者进行早期基因诊断，具有一定的可行性。

猪TNF-α竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪TNF-α的标准竞争曲线和直线回归方程.

竞争性RT-PCR法定量分析骨巨细胞瘤中TGFβ-1 mRNA的表达水平

目的 用竞争性PCR法检测骨巨细胞瘤（GCT）中TGFβ- 1mRNA，分析其对肿瘤预后的意义。方法 通过RT- PCR法制备内标和外标，将等量的内标和等比稀释的外标进行竞争性共扩增，得到标准曲线，然后将等量的内标和cDNA标本共扩增，通过标准曲线求出标本中TGFβ- 1mRNA的水平，并与GCT分级进行对比。结果 内标和外标在共扩增中表现出很强的竞争性。GCT中TGFβ- 1 mRNA的表达水平随着肿瘤分级的上升明显增加，局部复发和肺转移的标本中TGFβ- 1mRNA表达水平较未复发的标本高。结论 竞争性RT- PCR是一种灵敏，简便、快速检测GCT中TGFβ- 1mRNA表达水平的方法。应用该方法和肿瘤病理分级标准来综合判断肿瘤的预后，有着重要的临床意义。

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.

竞争RT-PCR定量测定IFN-γmRNA方法的建立

本文旨在探索定量测定IFN γmRNA的竞争RT PCR方法的最适条件。自行设计和制备了内标准品IFN γcDNA片段作为竞争模板 ,建立定量测定IFN γmRNA的竞争RT PCR法。用所建立的方法测定了健康人PBMC经一定浓度的calciumionophore和不同浓度的PMA培养不同时间所诱生的IFN γmRNA。结果表明 ,在calciumionophore 2 0 μmol/L浓度下 ,用PMA10 0ng/ml诱导 6h ,IFN γmRNA达最高水平。本法可对细胞内用于IFN γmRNA作定量测定和用于IFN γ基因表达机制的研究 ,方法简便且敏感。

猪IFN-γ竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪IFN-γ的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增380bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-TEasy载体中,构建成含IFN-γ部分基因片段的重组质粒。利用反向PCR技术构建和扩增380 bp片段共用同一对引物但缺失163 bp的竞争重组子。通过重组质粒与竞争重组子,建立猪IFN-γ的标准竞争曲线和直线回归方程,为进一步检测IFN-γ的mRNA的转录水平变化奠定基础。

竞争定量RT-PCR检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响

建立了奶牛肝PCmRNA丰度的竞争定量RT-PCR检测方法,优化的PCR反应条件(25μL)为:60℃退火、30个循环数、1:1的PC cDNA与PC DNA竞争模板浓度比。同时应用该方法检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响,结果表明:低能量日粮饲喂干奶期奶牛,肝脏PC mRNA丰度升高,而干奶期高能饲喂奶牛,肝脏PC mRNA丰度降低。说明干奶期低能饲喂奶牛,可以增强围产期奶牛的肝糖异生能力。

用于竞争性RT-PCR评估刚地弓形虫速殖子-缓殖子相互转换的多竞争体的构建与验证

刚地弓形虫感染中间宿主后几乎可以在所有组织内以速殖子形式快速增殖。宿主免疫功能正常时,宿主产生免疫力后,速殖子转变为缓殖子,在寄居部位形成包囊结构,长期存活。当宿主免疫功能降低时,包囊中缓殖子转变为速殖子,使疾病状态再现。

定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的研究携带类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态类整合酶基因(intI1)mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制。方法采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平。首先用PCR方法从类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA(cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA(cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1mRNA的表达量。结果两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍)。结论铜绿假单胞菌在生物被膜状态下类整合子intI1mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一。

鸭卵泡及精巢中卵泡抑素和抑制素/活化素β_B亚基mRNA表达的研究

卵泡抑素是与抑制素／活化素功能密切相关的一种糖蛋白激素，采用定量竞争ＲＴ－ＰＣＲ 技术对鸭各级卵泡及成熟与未成熟精巢中的卵泡抑素和抑制素／活化素βＢ亚基的ｍＲＮＡ表达 丰度进行了研究，发现在上述组织中均有此两基因ｍＲＮＡ的表达，且只在小卵泡中表达较丰 富。卵泡抑素在小黄卵泡（ＳＹＦ）中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则Ｆ１（最 大卵泡）、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６～８、ＬＷＦ（大白卵泡）、ＴＩ（未成熟精巢）和ＴＭ（成熟精巢）中卵泡抑素 ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为０．０１１±０．００４、０．０１９±０．００６、０．０２１±０．００９、０．０２８±０．００７、 ０．０７５ ± ０．０２３、０．１５ ± ０．０７２、０．２９ ± ０．０６８、０．０３７ ± ０．０１１和０．０１２±０．００４。βＢ亚基也在小黄卵 泡中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６－８、ＬＷＦ、ＴＩ和ＴＭ 中βＢ亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为：０．００９ ± ０．００３、０．０１３±０．００５、０．０１９ ± ０．００７、０．０２３ ± ０．００６、０．２９±０．０８４、０．８４±０．

鸭各级卵泡中抑制素α和抑制素/活化素β_A亚基信使RNA表达丰度的研究

采用非常灵敏的定量竞争 ＲＴ－ＰＣＲ技术对鸭各级卵泡中抑制素α和βＡ亚基的ｍＲＮＡ表达丰度作了研究，发现在各级卵泡中均有此两亚基ｍＲＮＡ的表达，大卵泡中的α亚基表达量要高于βＡ亚基。α亚基ｍＲＮＡ在小黄卵泡（ＳＹＦ）中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４／５、ＬＷＦ（大白卵泡）中α亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为： ０.２６±０．０５、０．２８±０．０７、０．５７±０．１２、０．９８±０．０９、０．０２６±０．００６。βＡ亚基 ｍＲＮＡ在Ｆ１中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则 Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４／５、ＳＹＥ、ＬＷＦ中βＡ亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为：０．２１８±０．０９、０．１１１±０．０３、０．０５８±０．０１１、０．０５３±０．０１３、０．００５±０．００２。结果显示，随着卵泡的增大α亚基表达量降低， βＡ亚基却增加，说明在卵泡发育过程中， α和βＡ亚基的表达是独立调节的，另外，βＡ亚基在Ｆ１中的大量表达，说明Ｆ１可能是形成二聚体抑制素／活化素的主要场所。

活化素和卵泡抑素对绍鸭卵泡颗粒细胞FSH受体mRNA表达作用的研究

分别用活化素 (Activin)、卵泡抑素 (FSP)及其组合 (Activin +FSP)来处理培养的鸭未成熟卵泡颗粒细胞 ,发现在FSH存在与不存在的情况下 ,Activin均能促进FSH受体mRNA的表达 ,且随着Activin浓度的增大 ,其刺激作用增强。FSP自身对FSH受体产生无显著作用 ,但能中和Activin对该受体产生的促进作用。这说明FSP和Activin对颗粒细胞具有自分泌作用 ,二者通过调节FSH受体mRNA的表达而在卵泡的生长发育过程中起着重要作用。

仙居鸡抑制素α亚基成熟区的cDNA克隆及其在卵泡中表达的研究

根据发表的鸡抑制素α亚基序列设计引物，用ＲＴ－ＰＣＲ技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总ＲＮＡ中扩增出了抑制素α亚基成熟区序列，并进行了克隆和测序。结果显示，仙居鸡成熟α亚基是由１１３个氨基酸（ａａ）残基组成的蛋白质，具有１个糖基化位点和７个半胱氨酸残基，与发表的鸡和哺乳类相应序列对比，其核苷酸序列的同源性分别为９８％和６１．４％～６８．７％，其预测氨基酸序列的同源性分别为９７．３％和６４．６％～６９％，且所测鸡α亚基成熟区的糖基化位点及半胱氨酸残基的数目和位置与发表的鸡和哺乳类相似，说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性，提示其可能具重要的生理功能。鸡各级卵泡中α亚基ｍＲＮＡ表达丰度的定量分析显示，从ＳＹＦ到Ｆ１中，随着卵泡的成熟α亚基的表达量降低，其在ＳＹＦ和Ｆ６～８中表达量最高，在ＬＷＦ中表达量很低，说明α亚基在卵泡的吸收、选择及优势化过程中起重要调节作用。

多特异性内参照模板的构建及应用

目的构建多特异性内参照模板,用于Fas、FasL、GB、P、TIA1和βactin的竞争性PCR定量。方法体外合成DNA单链,PCR扩增后,得到2个片段。片段1长145bp,含有Fas、FasL、GB、P、TIA1和βactin的5′引物序列;片段2长147bp,含有相同基因的3′引物序列。将片段1、2分别克隆在载体PKF3上。结果克隆载体经酶切鉴定及DNA序列测定,证实为本实验所设计的多特异性内参照模板,以此为模板,用不同的引物进行PCR扩增,即可得到相应的竞争内参照。应用多特异性内参照模板对移植肾急性排斥患者外周血淋巴细胞中TIA1进行定量,结果显示,底物量在一定范围内,靶序列和竞争性内参照模板的扩增效率基本一致,尤其是在指数期。这一结果同样适用于Fas、FasL、GB、P和βactin的定量。结论本实验构建的多特异性内参照模板可用于6种基因的竞争性PCR检测,为进一步研究打下了基础。