依赖于端粒延长替代机制的胶质瘤临床前模型及应用现状

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,主要起源于神经胶质细胞。由于胶质瘤具有高度侵袭性的特点,其死亡率在各种癌症中名列前茅。因此,新的治疗方法和新的药物开发对于胶质瘤的治疗意义十分重大。在大约30%的胶质瘤中,端粒的维持并不是通过端粒酶的激活延长的,而是通过端粒延长替代机制(ALT)来维持和延长端粒。然而,由于目前对于ALT胶质瘤细胞系以及临床前的ALT胶质瘤模型的研究还比较匮乏,从而制约了ALT胶质瘤的机制研究。因此,本篇综述在此探讨了目前发现的ALT胶质瘤细胞系及ALT胶质瘤动物模型,以及这些模型在临床前研究中发挥的作用和最新的进展。

ALT——端粒延长替代机制

端粒长度和结构的稳定与肿瘤及衰老的发生密切相关,端粒维持机制是细胞增殖的必要条件,端粒维持机制的激活是肿瘤细胞演化过程中的一个重要环节。这种端粒维持机制可能是通过重新激活端粒酶,使细胞快速增殖。在端粒酶失活或不足的情况下,也存在着一种或多种维持和增加端粒长度的机制,统称为端粒延长替代机制(Alterative lengthening of telomere,ALT)。其特点包括:具有不均一的端粒长度,存在与ALT相关的PML小体(APBs)以及同源重组增加。ALT细胞内存在的ALT相关蛋白及异常活跃的同源重组为ALT机制的激活和维持提供了可能。文章综述了ALT的特征性表型、与端粒酶的相关性及其可能的发生机制。对ALT机制的深入研究将有利于阐明衰老与肿瘤之间的辩证关系。

异柠檬酸脱氢酶1 R132H突变型胶质细胞瘤及其维持端粒的代偿机制

异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)R132H是II-III级胶质瘤和少突胶质细胞瘤中最常见的突变基因。绝大多数IDH1^(R132H)突变型胶质细胞瘤并没有通过端粒酶的激活(在端粒酶逆转录酶TERT的介导下以RNA为模板延伸端粒长度)作为其端粒维持机制,而是通过一种依赖于同源重组(homologous recombination,HR)的代偿机制来维持端粒长度,该机制被称为端粒延长替代(alterative lengthening of telomere,ALT),目前关于ALT形成的机制尚不完全清楚。最近的研究表明,端粒Shelterin复合物组分RAP1和非同源DNA末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复因子XRCC1的表达在IDH1^(R132H)突变的胶质细胞瘤中均一致下调,导致端粒功能障碍并促进HR。同时,IDH1^(R132H)突变通过下调去甲基化酶KDM4B的活性水平,与α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked,ATRX)基因缺失协同作用促进ALT途径。基于这些研究,本文就突变IDH1^(R132H)的表达如何引发端粒功能障碍并改变端粒处的DNA修复途径偏好,进而与ATRX丢失协同作用促进ALT发生的机制进行综述。为临床靶向治疗IDH1^(R132H)突变型胶质细胞瘤提供参考。

GADD45A通过端粒替代延长途径调控骨肉瘤细胞增殖

目的:探讨GADD45A对骨肉瘤细胞的增殖和端粒调控功能。方法:应用siRNA和shRNA处理骨肉瘤细胞U2OS,观察骨肉瘤细胞增殖、端粒功能和端粒延长替代途径的变化。qPCR检测GADD45A敲低后mRNA水平。CCK-8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖情况。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验检测端粒功能变化。免疫荧光-荧光原位杂交实验和C-circle实验检测端粒损伤情况和端粒延长替代途径相关表型。结果:qPCR结果表明,siRNA敲低GADD45A后mRNA水平降低(t=25.96,P<0.0001);shGADD45A-1和shGADD45A-2 GADD45A的mRNA水平降低(t=21.12、18.37,均P<0.0001)。对应的CCK-8(t=5.051、6.192、3.775、14.86、22.93、3.013、14.61、20.93,均P<0.05)和克隆形成实验(t=46.68、23.73、24.98,均P<0.0001)结果表明,敲低GADD45A抑制了骨肉瘤细胞增殖。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验结果显示,GADD45A缺失会加重端粒多信号(t=24.04、7.243、27.93,均P<0.01)和端粒信号缺失现象(t=8.222、16.61、6.781,均P<0.01)。免疫荧光-荧光原位杂交实验结果表明,siRNA敲低GADD45A后H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒的共定位增加(t=19.16、10.65,均P<0.0001);shGADD45A-1、shGADD45A-2也证实了H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒共定位的比例升高(t=14.71、24.03、16.69、18.10,均P<0.0001)。C-circle实验结果表明,siRNA敲低GADD45A以及shGADD45A-1和shGADD45A-2两细胞系中染色体外端粒DNA环C-circle水平升高(t=41.27、14.06、4.539,均P<0.05)。结论:GADD45A调控端粒延长替代途径、保护端粒功能并促进骨肉瘤细胞增殖。

端粒延长替代机制与DNA修复途径

端粒长度和结构的稳定与肿瘤及衰老的发生密切相关,端粒维持机制(telomere maintenance mechanism,TMM)的激活对稳定基因组和建立细胞永生化至关重要。85%~90%的肿瘤细胞是通过激活端粒酶来维持端粒长度的,10%~15%的肿瘤细胞在端粒酶失活或不足的情况下,利用同源重组或其他多种机制维持端粒长度,这些端粒维持机制统称为端粒延长替代机制(alterative lengthening of telomere,ALT)。ALT端粒DNA通过染色体外游离的端粒重复DNA来合成。这提示,在ALT端粒维持时进行的DNA修复机制可能有利于阐明衰老与肿瘤之间的辩证关系。该文从ALT端粒DNA维持的角度,阐述和总结了ALT肿瘤中几种DNA修复途径及ALT活性相关蛋白如何维持端粒长度和功能的完整性。

端粒延长技术在癌症治疗中的应用

癌症已经成为现代人最为恐慌的疾病,它的难预防、难诊断、难治疗是当前世界上最为头疼的难题。我国平均每年患癌人数高达三百多万,近年来受环境、食品等不良因素影响,癌症发病率逐年上升,致病患者平均年龄下降,癌症已经成为人类的头号杀手。导致癌症的罪魁祸首之一,就是端粒长度的变化和结构的稳定性。端粒长短与细胞的分裂次数息息相关,分裂次数增多则端粒长度逐渐缩小,最终细胞分裂能力下降、活性降低,逐渐走向凋亡。但在细胞分裂过程中,有些细胞会修复受损的端粒长度诱导DNA发生断裂,使正常细胞发生突变,导致癌细胞永生化。端粒延长技术的出现使人们了解了癌细胞拥有无限增殖能力的原因,本文将从端粒延长技术的作用原理出发,讨论端粒与癌细胞增殖之间的关系,并以此为靶点探究其在癌症治疗方面的作用,以期为后续癌症治疗研究提供参考。

替代性端粒延长机制与端粒

端粒的维持除了可以通过端粒酶的作用外 ,还可以通过其他途径。这种不依赖端粒酶的延长途径被称为替代性端粒延长机制。替代性端粒延长机制与端粒酶途径之间存在着抑制效应。二者延长端粒的效果不一样 ,以致其后续效应对肿瘤演变产生不同的影响。对替代性端粒延长机制的理解有助于阐明肿瘤的发生 。

端粒酶hTERT促进肿瘤细胞侵袭与转移及其机制研究

目的观察hTERT基因修饰对人骨肉瘤细胞系U-2OS生物学行为的影响。方法采用脂质体法将克隆有人全长cDNAhTERT的真核荧光质粒(pIRES2-EGFP-hTERT)转染端粒酶阴性的人骨肉瘤U-2OS细胞,经G418筛选,免疫组化和Westorn Blot鉴定后,检测其端粒酶活性的改变、生长周期以及生物力学的变化。结果成功转染人真核荧光表达载体的U-2OS细胞能有效抵抗G418,并可有效表达hTERT蛋白,细胞内端粒酶活性明显增强,G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高,并且还明显增强了对细胞外基质的粘附力。进一步采用Transwell小孔迁移实验检测发现,hTERT/U2OS侵袭能力明显增强。结论转染hTERT基因后,U-2OS细胞内可同时通过端粒酶途径延长端粒。hTERT基因修饰可促进细胞周期进程,促使细胞从G1期→S期。通过替代途径延长端粒的肿瘤细胞在hTERT基因修饰后,增殖能力及侵袭能力明显增强。

Erastin对骨肉瘤细胞生长及增殖的影响

目的:探究erastin对骨肉瘤(OS)细胞生长、增殖的影响及其分子机制。方法:使用STRING数据库构建OS易突变蛋白、铁死亡相关蛋白和端粒相关蛋白的相互作用网络。检测2.5μmol/L erastin处理OS细胞后铁死亡相关指标的变化、端粒替代延长(ALT)相关表型的变化、端粒损伤情况、端粒保护蛋白的变化和对OS细胞生长增殖、迁移的影响。结果:STRING蛋白相互作用网络分析显示,铁死亡相关蛋白、OS中突变蛋白和端粒相关蛋白相互作用网络包括RPA1、BARD1、UBE3A、AURKA、MDM2、SIRT1、CREBBP、IGFBP5、DDX5及EP300。2.5μmol/L erastin处理OS细胞后,Western印迹显示谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)4、SLC家族氨基酸转运蛋白(SLC7A11)表达量明显降低(t=13.24、4.399,均P<0.05),毛细血管扩张性共济失调和Rad3相关蛋白(ATR)表达量明显降低(t=10.68,P<0.001),端粒重复结合因子(TRF)1、2表达量明显升高(t=8.006、10.79,均P<0.01);丙二醛(MDA)检测显示脂质过氧化物含量升高(t=2.951,P<0.05);活性氧簇(ROS)检测试剂盒显示,ROS水平明显增加(q=11.03,P<0.001);ALT相关表型结果显示,c-circle水平明显降低(t=16.20,P<0.0001),早幼粒细胞白血病核小体(PML)与端粒的定位明显降低(t=6.018,P<0.01);免疫荧光结果显示,53BP1、γ-H2AX与端粒的定位明显增加(q=4.391、4.653,均P<0.05);CCK8、克隆形成实验结果显示,细胞生长增殖水平降低(t=10.86、4.972,均P<0.01);划痕实验结果表明,细胞的迁移水平降低(t=2.953,P<0.05)。结论:伴随铁死亡的发生,erastin可以减弱ALT并抑制OS细胞的生长、增殖和迁移。

以替代延长机制维持端粒的胃肠道恶性肿瘤hRad21蛋白表达的研究及临床病理分析

目的了解以替代延长机制（ALT）维持端粒的胃肠道恶性肿瘤所占比例及其临床病理特点，并研究肿瘤组织中hRad21蛋白的表达。方法通过端粒重复放大（TRAP）分析方法检测104例胃肠道恶性肿瘤标本的端粒酶活性；根据检测结果将标本分为端粒替代延长机制组（ALT组）和端粒酶组．然后研究两组标本中hRad21蛋白的表达差异，并分析患者的临床病理和随访资料。结果ALT组有12例（11．5％），hRad21蛋白在ALT组的表达要高于端粒酶组。临床病理分析显示，ALT组的肿瘤浸润深度小于端粒酶组（P=0．021）。随访到第30个月时，ALT组的生存率为100％，而端粒酶组的生存率为56％。结论胃肠道恶性肿瘤存在通过ALT途径来维持端粒长度者，与端粒酶阳性肿瘤比较，ALT肿瘤的hRad21蛋白表达较高，肿瘤的侵袭性较弱，生存率较高。

端粒的替代性延长(ALT)和端粒酶非催化功能在肿瘤中的研究进展

端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白,由非编码RNA模板(端粒酶RNA成分,telomerase RNA template component,TERC)和蛋白成分共同构成,能在酶亚基(端粒酶逆转录酶,telomerase reverse transcriptase,TERT)作用下,从头合成端粒DNA序列[1]。人类胚胎发育早期,很多组织可检测到端粒酶活性,但妊娠12~18周时发生了转录沉默.

RTEL1基因多态性与COPD易感性的相关性研究

目的研究端粒延长解旋酶1(RTEL1)基因rs4809324、rs6010620位点单核苷酸多态性(SNPs)与慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性之间的相关性。方法选择315例COPD患者作为研究对象,同期招募240例健康体检者作为对照组。采用Sanger测序法检测所有受试者的RTEL1基因rs4809324、rs6010620位点基因型,并分析其与COPD易感性和严重程度的相关性。结果研究组rs4809324位点突变纯合型CC基因频率明显高于对照组,差异有统计学意义(χ2=7.12,P<0.05),该位点突变型等位基因C基因频率亦明显高于对照组(校正后OR=1.19,95%CI 1.06~1.32)。研究组rs6010620位点各基因型频率和等位基因频率与对照组比较,差异均无统计学意义(χ2分别=2.67、0.86,P均>0.05)。RTEL1基因rs4809324位点突变型等位基因C携带者COPD的严重程度明显高于野生型等位基因携带者,差异有统计学意义(χ2=9.29,P<0.05),校正后OR为1.23,95%CI 1.07~1.39。rs6010620位点SNP与COPD严重程度比较,差异均无统计学意义(χ2分别=2.67、0.08,P均>0.05)。结论 RTEL1基因rs4809324位点单核苷酸多态性与COPD易感性有关,突变型C等位基因携带者具有较高的COPD患病风险,且更易发展为重症的COPD。

RNaseH-1抑制端粒酶阴性骨肉瘤并增强放射敏感性

目的研究核酸内切酶RNaseH-1对使用端粒的替代延长(ALT)机制来延长端粒的骨肉瘤细胞放射敏感性影响及机制。方法通过慢病毒转染构建过表达RNaseH-1的ALT骨肉瘤细胞U2OS和端粒酶阳性骨肉瘤细胞143B。对转染后的细胞使用CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期。克隆形成实验检测放射敏感性,免疫荧光实验检测细胞DNA损伤(γ-H2AX灶点)情况,蛋白印迹法实验检测相关蛋白表达水平。结果过表达RNaseH-1后U2OS细胞的增殖能力显著降低,且细胞周期阻滞于G1期(均P<0.05)。U2OS细胞中RNaseH-1的过表达使ATM和Chk2的磷酸化水平显著升高、同源重组相关蛋白RAD51和BRCA1的表达显著降低,并导致细胞中DNA损伤水平显著上升、细胞放射敏感性增强(均P<0.05)。而过表达RNaseH-1不对端粒酶阳性的143B细胞产生抑制效应(P>0.05)。结论过表达RNaseH-1抑制了端粒酶阴性骨肉瘤细胞并增强了放射敏感性,其机制可能是RNaseH-1在ALT细胞中抑制同源重组修复并激活ATM信号通路。

WHOⅡ级脑胶质瘤患者无进展生存期的影响因素分析

目的分析世界卫生组织(WHO)Ⅱ级脑胶质瘤患者无进展生存期的影响因素。方法回顾性纳入2008年1月至2015年12月首都医科大学三博脑科医院神经外科收治的72例成人WHOⅡ级脑胶质瘤患者,对患者行手术切除肿瘤。术后对组织样本采用免疫组织化学染色方法检测异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)R132H、α地中海贫血或精神发育迟滞综合征X染色体相关基因(ATRX)及端粒延长酶调节因子1(RTEL1)的突变情况。采用Kaplan-Meier生存曲线分析IDH1 R132H、ATRX及RTEL1表达不同的患者无进展生存期的差异。采用单因素和多因素Cox回归分析方法进一步评价影响患者预后的各临床因素。结果72例脑胶质瘤患者免疫组织化学染色结果为,39例(54.2%)IDH1 R132H染色阳性,33例(45.8%)阴性;56例(77.8%)ATRX染色阴性,16例(22.2%)阳性;29例(40.3%)RTEL1染色阳性,43例(59.7%)阴性。生存期分析结果显示,IDH1 R132H阴性患者的累积无进展生存率低于IDH1 R132H阳性者(P<0.05),ATRX阳性与阴性患者累积无进展生存率间的差异无统计学意义(P>0.05),RTEL1阳性患者的累积无进展生存率低于RTEL1阴性患者(P<0.05)。单因素和多因素Cox回归分析结果显示,年龄>40岁(OR=3.618,95%CI:1.688~7.753,P=0.001)、肿瘤部分切除(OR=0.204,95%CI:0.064~0.656,P=0.008)、IDH1R132H表达阴性(OR=2.867,95%CI:1.129~7.282,P=0.027)及RTEL1表达阳性(OR=0.354,95%CI:0.151~0.827,P=0.016)为胶质瘤患者无进展生存期的独立影响因素,可独立用于患者的预后判断。结论年龄>40岁、肿瘤部分切除、IDH1R132H表达阴性及RTEL1表达阳性是影响WHOⅡ级脑胶质瘤患者无进展生存期的独立危险因素。