定量实时RT-PCR检测非霍奇金淋巴瘤端粒结合因子2 mRNA的表达

目的 :建立定量实时 RT- PCR,研究非霍奇金淋巴瘤 (NHL)患者肿瘤组织端粒结合因子 2 (TRF2 )m RNA表达。方法 :用 RT- PCR扩增目标基因 c DNA,电泳后切胶、纯化作为标准品 ,建立待测基因标准曲线 ;用实时 RT- PCR测定 32例 NHL和 8例反应性淋巴结炎患者淋巴组织 TRF2的表达。结果 :实时 RT- PCR标准曲线中 ,模板 c DNA含量和扩增时产生的荧光信号相关系数为 0 .996。实时 RT- PCR终点产物凝胶电泳的基因条带灰度值和模板 c DNA含量的相关系数为 0 .779(P<0 .0 5 )。在 NHL患者中 ,滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大 B细胞淋巴瘤 TRF2 m RNA表达量分别为 (2 2 .94 3± 9.4 2 4 ) amol、(2 3.181± 5 .983) amol和 (18.339± 7.910 ) amol,与良性反应性淋巴结炎组织 [(2 1.796± 4 .80 0 ) amol]相比无显著性差异 (P>0 .0 5 )。但 Burkitt淋巴瘤 TRF2 m RNA表达量为 (33.170± 12 .84 1) amol,显著高于良性反应性淋巴结炎组织和其他类型恶性淋巴瘤 (P<0 .0 5 )。结论 :定量实时 RT- PCR能精确测定目标基因 m RNA表达。在 NHL中 ,Burkitt淋巴瘤 TRF2 m RNA表达量明显高于滤泡型淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、弥漫性大 B细胞淋巴瘤。

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达。方法:EcoR I,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1600bp小片段,连接入pcDNA3.1载体。经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照。G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆。①细胞用阿霉素处理6h后Westernblot法检测TRF2表达。②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响。结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P>0.05)。结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础。

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。

急性白血病细胞端粒结合蛋白2表达的研究

目的:研究人类白血病细胞株及原代白血病细胞中人端粒结合蛋白2(TRF2)的表达。方法:应用实时定量RT-PCR,检测白血病细胞株及原代白血病细胞中TRF2 mRNA的表达,应用Western Blot,检测TRF2蛋白的表达。结果:T淋巴系白血病细胞株的TRF2表达显著高于骨髓单个核细胞和髓系白血病细胞株。在原代白血病细胞中,M0和M1亚型患者白血病细胞TRF2的表达高于其他各亚型急性髓系白血病(AML)患者。结论:预后差的AML患者和T细胞恶性肿瘤细胞株高表达TRF2,提示TRF2高表达可能和白血病的预后有关。

胶质瘤细胞端粒结合因子与ING1基因表达关系的研究

端粒结合因子(TRF1和TRF2)及抑癌基因ING1表达异常减少与多种颅外肿瘤的发生、发展密切相关。本研究是为了探讨胶质瘤细胞TRF1、TRF2和ING1基因表达变化的相互关系及其在胶质瘤发生、发展中的作用。方法:采用mRNA原位杂交和免疫组化染色等方法观察了70例不同级别的人胶质瘤组织标本。结果:本组70例胶质瘤INGl mRNA、P33^(ING1)蛋白、TRF1蛋白和TRF2蛋白的阳性表达率分别为94.3%、88.6%、100.0%和98.6%,I～Ⅱ级组、Ⅲ级组及Ⅳ级组间比较它们的阳性表达率均无显著性差异(P>0.05)。表达INGl mRNA、P33^(ING1)蛋白、TRF1蛋白和TRF2蛋白的四种阳性肿瘤细胞密度彼此间均呈显著性正相关(r=0.739～0.847,P<0.001),并均随肿瘤级别升高而相应减少,不同级别组间比较差异均有显著性(P<0.01)。结论:以上指标对评价胶质瘤的生物学行为均有重要参考价值,胶质瘤细胞中TRF1蛋白及TRF2蛋白表达异常减少可能是导致其ING1基因表达下调的重要因素,它们的表达异常减少可能在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用。

人端粒保护蛋白POT1和TRF2在喉癌中的表达

目的探讨人端粒保护蛋白1(human protection of telomeres1,POT1)和端粒重复序列结合因子2(telomeric repeat binding factor-2,TRF2)在喉鳞状细胞癌(简称喉癌)及声带息肉中的表达及意义。方法采用间接免疫荧光法检测20例喉癌、19例声带息肉中POT1和TRF2的表达水平。结果POT1和TRF2在喉癌中的阳性表达率为65.00%和70.00%,在声带息肉中未见POT1和TRF2的表达。POT1在低分化喉癌中的表达高于POT1在高及中分化喉癌中的表达(P<0.05),POT1的表达水平在喉癌的不同发生部位、T分级、临床分期及淋巴结转移率中的差异无统计学意义(P<0.05)。TRF2的表达程度与肿瘤的发生部位、组织病理、T分级、淋巴结转移率和临床分期均无关(P<0.05)。相关分析显示喉癌中POT1的表达与TRF2的表达无相关性(P<0.05)。结论POT1和TRF2在喉癌中高表达,两者在喉癌的发生中可能起重要作用。POT1在喉癌中的表达与肿瘤的分化程度有关。

端粒保护蛋白TRF2在肿瘤发生和治疗中作用机制的研究进展

端粒重复序列结合因子2(telomeric-repeat binding factor 2,TRF2)是一种重要的端粒保护蛋白,与端粒保护蛋白1(protection of telomeres 1,POT1)、端粒重复序列结合因子1(telomeric-repeat binding factor 1,TRF1)、相互作用核蛋白2(TRF1-interacting nuclear protein 2,TIN2)、阻滞活化蛋白1(repressor activator protein 1,Rap1)以及TPP1,5个核心蛋白通过一系列相互作用共同形成端粒保护蛋白复合体(shelterin)以维持端粒结构和功能的稳定性和完整性。越来越多的研究显示TRF2在多种肿瘤中异常表达并与肿瘤的发生,肿瘤细胞的耐药以及肿瘤血管的生成密切相关。因此,本文就TFR2的结构与生理功能,以及其在肿瘤发生,发展与治疗中的作用研究进展进行综述,以期为肿瘤的预防和治疗提供新的思路。

DNA损伤诱导胃癌细胞端粒酶活性和TRF2表达增高

目的:检测在化疗药引起胃癌细胞DNA损伤过程中端粒酶、TRF1和TRF2的表达.方法:用不同浓度足叶乙甙处理胃癌细胞SGC7901和MKN28,分别在3,6,12,24和36h进行检测.采用实时定量TRAP分析检测端粒酶活性;用实时RT-PCR检测hTERTmRNA表达;用Westernblot和实时RT-PCR检测TRF1和TRF2表达.结果:两种细胞端粒酶活性及TRF2mRNA表达均在药物处理的早期明显增高(P<0.05),且显示明显的药物浓度依赖性(P<0.05);TRF1表达稍增高,但无统计学意义(P>0.05).hTERTmRNA表达无明显改变(P>0.05).TRF2表达在蛋白和mRNA水平均增高(P<0.05).结论:端粒酶和TRF2参与化疗药引起的胃癌细胞DNA损伤反应.

脐血铅对端粒长度影响及其与TRF1和TRF2相关性

目的研究低水平脐血铅对新生儿端粒长度的影响及其与端粒重复序列结合因子1(TRF1)、端粒重复序列结合因子2(TRF2)的相关性。方法收集孕期无急慢性疾病的足月顺产儿脐血88例,采用原子吸收光谱法测定脐血铅浓度,以脐血铅浓度30μg/L为界分为安全浓度组(脐血铅浓度<30μg/L)48例、中毒浓度组(脐血铅浓度≥30μg/L)40例,采用全血提取基因组法提取两组脐血DNA,荧光定量PCR法测定基因组DNA的端粒长度,ELISA法测定TRF1、TRF2的浓度。结果安全浓度组端粒长度长于中毒浓度组,差异有显著性(t=2.479,P<0.05)。端粒长度与脐血铅浓度呈负相关(r=-0.301,P<0.05),TRF1与脐血铅浓度呈正相关(r=0.528,P<0.05),TRF2与脐血铅浓度呈负相关(r=-0.361,P<0.05)。结论脐血铅可通过增加TRF1表达、减少TRF2的表达来干扰新生儿端粒长度的延长,进而导致端粒长度的缩短。

联合干扰人端粒酶逆转录酶和端粒重复序列结合因子2基因的表达对乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用

目的探讨联合干扰人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因和端粒重复序列结合因子2（TRF2）基因在乳腺癌基因治疗中的协同效应。方法构建表达小分子干扰RNA（siRNA）-hTERT和siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-hTERT和rAd-TRF2，单独或联合转染人乳腺癌MCF-7细胞。采用Westernblot法检测MCF-7细胞中hTERT和TRF2蛋白的表达，采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测MCF-7细胞的增殖抑制情况，采用流式细胞仪检测MCF-7细胞的细胞周期变化，采用细胞平板克隆形成实验检测MCF-7细胞的克隆形成能力。结果转染48h后，PBS对照组、空载体对照组、阴性对照组、rAd—hTERT转染组、rAd-TRF2转染组以及rAd—hTERT和rAd-TRF2联合转染组乳腺癌MCF-7细胞中hTERT蛋白的相对表达量分别为1．00、0．94±0．02、0．95±0．04、0．18±0．04、0．95±0．01和0．18±0．04；TRF2蛋白的相对表达量分别为1．00、1．01±0．08、0．96±0．02、0．95±0．08、0．22±0．01和0．26±0．02。单独转染tad—hTERT或tad—TRF2后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率仅为54．6％和48．4％，有8．9％±1．2％和9．2％±2．3％的细胞进入分裂期，66．4％±1．5％和64．6％±1．9％的细胞阻滞于G0＋G1期，细胞的克隆形成能力显著下降；联合转染rAd—hTERT和rAd—TRF2后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率高达82．1％，进入分裂期的MCF-7细胞明显减少（为4．4％±1．2％），大量细胞阻滞于G0＋G1期（为81．4％±1．3％），细胞的克隆形成能力下降更加明显。结论联合干扰hTERT和TRF2基因较单基因干扰可获得更有效的乳腺癌基因治疗效果。

TRF2小干扰RNA载体的构建及表达

目的:构建TRF2小干扰RNA载体,观察其在胃癌细胞中的表达．方法:根据pSilencer3．1-H1载体要求设计两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点．经双酶切及测序鉴定后分别转染多药耐药衍生胃癌细胞SGC7901／ADR和SGC7901/VCR． G418选择培养液培养2 mo选取转染组及对照组细胞克隆．MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响．细胞用阿霉素和足叶乙甙处理 6h后Western blot法检测TRF2表达．结果:成功构建TRF2小干扰RNA载体,建立稳定转染细胞株,转染后TRF2表达明显降低,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P>0．05)．结论:成功构建TRF2小干扰RNA载体及稳定转染细胞株．

胎儿心肌细胞端粒相关蛋白的表达

目的探讨端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒酶相关蛋白1(TP1)和端粒重复结合因子2(TRF2)表达与心肌细胞分化和发育的关系。方法应用S-P免疫组化方法分别对不同月份胎儿心肌细胞TERT、TP1和TRF2蛋白表达进行检测。结果胎儿心肌细胞核中TERT的表达随胎龄增加而减少;胎儿心肌细胞胞浆TP1和TRF2的表达随胎龄增加而增加。结论TERT、TP1和TRF2表达方式可能促使部分心肌细胞永久退出细胞周期而进入终末分化和肥大阶段。

端粒重复序列结合因子2小干扰核糖核酸逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

阿霉素（Adriamycin，ADR）和依托泊苷是临床常用的肿瘤化学治疗药物，主要作用机制为抑制DNA拓扑异构酶，导致DNA双链断裂（double—strand DNA breaks，DSB）。肿瘤细胞发生耐药与多种机制有关，其中对DNA损伤修复的影响是其中重要的一环。端粒重复序列结合因子2（telomeric repeat binding factor2，TRF2）能够通过维持端粒末端的T环结构，防止端粒被DNA损伤修复机制检测为DSB，维持端粒的正常结构和功能。

TRF2在食管鳞癌中的表达及意义

目的:探讨端粒重复序列结合因子2(Telomeric repeat binding factor2,TRF2)在食管病变中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化ABC法检测60例食管鳞状细胞癌、30例食管上皮内瘤变和20例食管正常组织中TRF2的表达,并探讨与食管癌临床病理特征之间的关系。结果:在正常上皮组织、上皮内瘤变和食管鳞癌组织中,TRF2的阳性表达率分别为35%、56.7%和96.7%。食管鳞癌组织中,TRF2的表达与淋巴结转移和病理分级呈轻度正相关(P<0.01)。结论:TRF2在食管癌组织中表达异常增高,提示TRF2与食管癌的发生、发展有密切的关系,检测TRF2的表达可能成为判断食管鳞癌生物学行为的重要指标。

RHPS4限制端粒重复序列结合因子2蛋白的端粒保护作用

目的 :探讨抗肿瘤药物RHPS4影响端粒重复序列结合因子2(TRF2)对端粒保护作用的机制。方法:在过表达TRF2的A375细胞体系中加入RHPS4,通过蛋白质印迹及免疫荧光结合共聚焦显微镜成像技术检测细胞DNA损伤情况,通过流式细胞技术及细胞增殖实验检测药物对细胞增殖的影响。结果 :在A375细胞中过表达外源性TRF2能抑制DNA损伤的修复,但过表达TRF2不能抑制RHPS4诱导端粒损伤,RHPS4诱导的细胞周期停滞和细胞衰老过表达不依赖于TRF2的表达量。结论:TRF2高水平表达不能拮抗RHPS4的致端粒损伤和细胞周期抑制的作用,肿瘤细胞中高表达TRF2不是应用RHPS4药物的反指征。

端粒重复序列结合因子1、2在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的探讨端粒重复序列结合因子1(TRF1)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义。方法利用免疫组织化学SP(SP)法检测46例子宫内膜癌组织和32例正常子宫内膜组织中TRF1和TRF2蛋白的表达,分析临床病理特征与TRF1和TRF2蛋白表达的关系。结果 TRF1蛋白在子宫内膜癌组织中的阳性表达率为32.61%,明显低于正常子宫内膜组织阳性表达率87.50%,差异有统计学意义(P<0.05),TRF2蛋白在子宫内膜癌组织中的阳性表达率为76.09%,明显高于正常子宫内膜组织阳性表达率34.38%,差异有统计学意义(P<0.05);TRF1蛋白低表达和TRF2蛋白高表达与子宫内膜癌病理分级、临床分期、淋巴结是否转移及病理类型等临床病理特征均无相关性(P>0.05);Spearman相关性分析结果显示,TRF1与TRF2在子宫内膜癌组织中的表达呈负相关。结论 TRF1蛋白在子宫内膜癌组织中呈现低表达,TRF2蛋白在子宫内膜癌组织中呈现高表达,推测两者对早期诊断子宫内膜癌具有一定的临床价值。

斑马鱼体内氧化损伤标志物筛选

目的:探讨以端粒为靶点的氧化损伤标志物的筛选,进而可能可以用来临床上早期发现或预报氧化损伤。方法:采用端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因敲除(TRF2-/-)斑马鱼胚胎作为氧化损伤模型,RT-q PCR法检测野生型和TRF2-/-斑马鱼胚胎中TRF2、PUM3、PACSIN3 mRNA的表达情况。构建pCS2-PUM3、pCS2-PACSIN3质粒并体外转录后,将mRNA分别显微注射至TRF2-/-斑马鱼受精卵中,比较注射组与未注射组斑马鱼畸形率。结果:RT-q PCR结果表明,与野生型斑马鱼胚胎相比,TRF2-/-斑马鱼胚胎TRF2、PUM3、PACSIN3 mRNA的表达量下降(P<0.05)。显微注射PUM3 mRNA至TRF2-/-斑马鱼受精卵后斑马鱼胚胎畸形率下降(P<0.05)。结论:TRF2能影响氧化应激相关基因PUM3、PACSIN3的表达,且PUM3能补救TRF2缺失造成的氧化损伤相关器官畸形。

人胃黏膜端粒功能障碍与慢性萎缩性胃炎的相关性研究

目的探讨人胃黏膜端粒功能障碍与慢性萎缩性胃炎(CAG)的相关性。方法选择2019年2月12日至2020年7月10日于中国中医科学院广安门医院内镜中心行胃镜检查并经病理诊断为CAG的患者30例(CAG组),同期选择慢性非萎缩性胃炎(CNAG)患者30例(CNAG组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测所有患者病理标本的胃黏膜相对端粒长度,采用免疫组织化学染色半定量分析检测端粒重复序列结合因子(TRF)1、TRF2、端粒保护蛋白(POT)1的蛋白质表达水平。采用Spearman相关分析检验胃黏膜相对端粒长度与TRF1、TRF2、POT1蛋白质表达水平的相关性。统计学方法采用Mann-Whitney U检验和独立样本t检验。结果CAG组胃黏膜相对端粒长度短于CNAG组[0.67(0.51,1.17)比1.06(0.69,1.37)],差异有统计学意义(U=297.00,P=0.024)。CAG组TRF1、TRF2、POT1的蛋白质表达水平分别高于CNAG组(4.26±2.49比1.86±1.34、10.12±2.76比8.78±2.81、4.22±2.48比2.53±1.62),差异均有统计学意义(t=8.05、3.23、5.39,P<0.001、=0.001、<0.001)。CAG组胃黏膜TRF2、POT1蛋白质表达水平与胃黏膜相对端粒长度均呈负相关(r=-0.477、-0.417,P=0.008、0.022)。结论端粒功能障碍与CAG的发病存在一定关系,端粒结合蛋白表达水平的改变参与了CAG患者端粒缩短和病理过程。

RNAi沉默TRF2基因对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的影响

目的:探讨采用RNA干扰技术沉默端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的作用情况。方法:构建特异性表达TRF2mRNA且含有荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA,并将其转染Hep-2细胞,采取PCR琼脂糖凝胶电泳检验靶基因TRF2表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,cell counting kit-8(CCK-8)法观察细胞增殖活性。结果:Hep-2细胞被转染后,TRF2基因表达明显受抑,细胞凋亡发生,增殖活性明显降低。结论:RNA沉默TRF2可明显抑制人喉鳞状癌细胞的增殖,促进细胞发生凋亡。