人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的探讨人端粒酶催化亚单位基因（human telomerase catalytic subunit，hTERT）Ex2-659A／G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系。方法对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者（病例组）和同期在上述医院查体的健康人群156例（对照组）进行病例对照研究；采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术（PCR—RFLP）对2组进行基因型分析，比较各基因型分布频率和发病风险的关系。结果病例组hTERT Ex2-659A／G位点AA、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异。病例组A、G等位基因频率分别为44．74％和55．26％，对照组为43．42％和56．58％，2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异（χ^2=5．3734，P=0．0204）。与G／G基因型相比，A／G和A／A2种基因型的个体患胃癌的危险度（OR）分别为0．519（95％CI：0．310—0．870，P=0．013）、0．550（95％CI：0．255～1．188，P=0．128）。结论hTERT Ex2-659A／G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

端粒酶催化亚单位基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用端粒酶催化亚单位基因(h TERT)异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(h MSCs)系。方法使用含有h TERT的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经新霉素G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。细胞免疫组化染色显示有h TERT的表达。结论成功地构建了h TERT永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。

榄香烯对HeLa细胞端粒酶催化亚单位基因表达的作用

目的 :探讨HeLa细胞凋亡过程中 ,人乳头瘤病毒 18型E6 (HPV18 E6 )基因、p5 3基因、端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因表达的变化 ,为临床诊断、治疗宫颈癌提供新思路。方法 :用流式细胞仪、电镜证实细胞凋亡 ;用PCR和RT PCR方法研究HPV18 E6基因、p5 3基因、hTERT基因表达在细胞凋亡过程中的变化及相互关系。结果 :在榄香烯作用下 ,HPV18 E6基因、p5 3基因表达没有变化 ,但hTERT基因表达受到抑制。结论 :榄香烯诱导HeLa细胞凋亡过程中 ,hTERT基因表达受到明显抑制 ,对于耐药性肿瘤 。

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Westernblot检测hTERT蛋白及I、III型胶原表达。染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白和I、III型胶原表达增加,体外传代次数增加,传至75代仍保持以2d的倍增周期生长,并且染色体仍为23对,均为正常二倍体细胞;裸鼠皮下不具有成瘤的能力;而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次,出现生长停滞现象。结论外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维细胞增殖旺盛,寿命延长,且不具有恶性表型。

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向.结果:经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0+6.4 kb两条带.反义重组质粒为1.0+2.5+3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性.结论:成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.

特异性人端粒酶催化亚单位基因小干扰RNA对HeLa细胞生长的抑制作用

通过设计并化学合成人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性siRNA,观察其对hTERT表达水平及肿瘤细胞生长的影响。将hTERT-siRNA以脂质体法转染入HeLa细胞,应用RT-PCR、实时定量TRAP、Western印迹、软琼脂克隆形成实验、荷瘤裸鼠肿瘤内注射等方法检测细胞内hTERTmRNA、蛋白质表达水平及对肿瘤细胞生长的影响。RT-PCR、实时定量TRAP和Western印迹的结果显示hTERT-siRNA明显降低了HeLa细胞内hTERT的mRNA及蛋白质表达水平并伴随有端粒酶活性的下降。克隆形成实验表明hTERT-siRNA组的体外肿瘤形成能力受到抑制。荷瘤裸鼠肿瘤内注射hTERT-siRNA使肿瘤平均体积显著小于对照组。TUNEL凋亡检测表明hTERT-siRNA转染组的凋亡率明显高于对照组。研究表明hTERT特异性siRNA可以明显抑制HeLa细胞内hTERT的表达水平,对其生长有明显抑制作用,是一种有前途的肿瘤治疗新方法。

反义人端粒酶催化亚单位基因转染对人结肠癌细胞恶性表型的逆转作用

利用基因重组技术,人端粒酶催化亚单位基因反向插入真核表达载体pcDNA3.0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞.该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落.说明反义hTRT基因体外导入结肠癌细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的增殖且能使其恶性表型发生逆转.

端粒酶催化亚单位基因hTERT反义寡核苷酸与顺铂对Raji细胞协同作用的研究

目的 :研究端粒酶催化亚单位基因hTERT反义寡核苷酸可否增强Raji细胞对顺铂 (CDDP)的敏感性。方法 :hTERT基因的反义寡核苷酸作用Raji细胞 2 4h后 ,加入CDDP ,用台盼蓝拒染的方法计数活细胞、计算对细胞生存的抑制率。结果 :单纯hTERT反义寡核苷酸在浓度为 10 μmol/L时 ,对Raji细胞生存无明显抑制作用 ;但反义寡核苷酸加CDDP组对Raji细胞生存的抑制率明显高于随机序列 +CDDP组 (P <0 .0 5 ) ,其抑制作用在反义寡核苷酸作用 48h、CDDP作用 2 4h时最为显著 (P <0 .0 1)。结论 :hTERT基因的反义寡核苷酸与CDDP具有协同作用 。

构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体转染人骨髓基质细胞

背景:骨髓基质细胞不表达端粒酶,因而在体外传代扩增过程中端粒长度逐渐缩短,导致细胞衰老,这是限制其用于细胞治疗应用的一个重要因素。目的:构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体,探讨以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法:以pReceiver-M02-hTERT质粒为模板PCR扩增获得目的基因。用BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上。然后使用LR重组系统将目的序列重组到载体pLenti6.3/V5-DEST上。将重组载体与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞获得慢病毒颗粒。结果与结论:成功构建人端粒酶催化亚单位慢病毒表达载体,病毒的平均物理滴度为1.07×1012LP/L。以之转染人骨髓基质细胞,目的基因表达水平有显著提升,细胞正确表达人端粒酶反转录酶蛋白。说明以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞能强化细胞表达人端粒酶催化亚单位。

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术，构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，采用脂质体法导入ＳＧＣ－７９０１细胞，检测细胞生长曲线、端粒酶活性凋亡、细胞周期、软琼脂中克隆形成率及裸鼠体内成瘤性的变化。结果 成功构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，并导入ＳＧＣ－７９０１胃癌细胞株中，获得稳定表达正、反义基因的细胞系７９０１－Ｓ、７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２。７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２出现显著生长抑制现象，端粒酶活性明显下降，细胞凋亡增加，异型性减小，Ｇ０／Ｇ１期细胞增加，Ｓ和Ｇ２Ｍ期细胞减少，增殖指数减小，软琼脂中无克隆形成，裸鼠体内成瘤消失。结论ｈＴＲＴ反义基因治疗可以明显抑制ＳＧＣ－７９０１细胞的增殖，部分逆转肿瘤细胞的恶性表型，其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的，提示ｈＴＲＴ基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。方法1用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。结论hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。

端粒酶催化亚单位基因反义寡核苷酸诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位(hTRT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用。方法合成针对hTRT的28mer ASODN,转染前列腺癌细胞12～36 h后,细胞计数、透射电镜、DNA Ladder、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测癌细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)技术检测hTRT基因表达和端粒酶活性。结果0.5～2.0μmol/L ASODN转染后,癌细胞体外生长抑制16.08％～53.41％(P<0.05),部分癌细胞呈现凋亡形态学改变和DNA片段化,凋亡率为9.36％～37.54％(P<0.05),hTRT表达减弱24.48％～86.73％(P<0.01),端粒酶活性降低24.74％～76.72％(P<0.01)。 结论运用ASODN阻断端粒酶hTRT基因表达,能降低端粒酶活性,显著诱导前列腺癌细胞凋亡。

靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的观察靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法从Genebank中钓取人端粒酶催化亚单位基因hEST2的mRNA序列，通过计算机模建二级结构辅助设计并合成硫化修饰反义寡核苷酸（癌泰得）。采用人肝癌裸小鼠原位移植模型（HCM—Y89）。实验分为生理盐水组，5-Fu10mg／kg组，癌泰得50mg／kg组、75mg／kg组，癌泰得75mg／kg联合5-Fu10mg／kg组、50mg／kg联合5-Fu10mg／kg组。尾静脉给药，每天1次，连续20d。观察移植瘤质量和抑瘤率、移植瘤体积、AFP浓度和移植瘤组织学。结果（1）5-Fu10mg／kg组的抑瘤率为27．85％，其他各治疗组的抑瘤率均在42．14％～74．29％之间；（2）各治疗组瘤质量、瘤体积和AFP浓度均低于生理盐水组且差异有统计学意义；（3）瘤体积和AFP浓度之间呈直线关系，为显著正相关（r=0．9977）；（4）癌泰得和5-FU治疗人肝细胞癌后，肝癌细胞出现不同程度的凋亡、坏死，同时伴有纤维组织增生。结论癌泰得对肝癌细胞生长具有抑制作用，疗效优于5-FU；与5-FU合用具有协同抗肿瘤效应。

非小细胞肺癌端粒酶催化亚单位的表达及其与c-myc基因的相关性

目的 研究端粒酶催化亚单位 (hTERT)在非小细胞肺癌的表达及其与c -myc基因的相关性 ,并探讨肺癌hTERT激活的可能调节机制。方法 应用荧光半定量逆转录聚合酶链反应方法 (RT -PCR)检测非小细胞肺癌组织hTERT及c-mycmRNA表达水平 ,对两者进行统计学相关分析。结果 5 1例非小细胞肺癌hTERT表达阳性率为 86 .3% ,明显高于癌旁正常肺组织和良性病变组织 (分别为 14 .3%和 2 7.3% )。hTERT的表达和肿瘤组织病理类型、分化程度、临床分期、肿块大小及淋巴结转移指标间未见明显相关性。相关分析显示hTERT与c-mycmRNA表达存在显著相关性 ,相关系数r =0 .6 33(P <0 .0 0 1)。结论hTERT对肺癌诊断具有潜在临床价值 ,hTERT的表达与c -myc表达存在显著相关性 ,进一步支持c -myc的过度表达可能是肺癌端粒酶激活和调节的机制之一。

人胃癌组织端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的相关性

【目的】探讨胃癌组织中端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的关系。【方法】采用改良端粒重复扩增法(TRAP)和 RT-PCR 扩增法检测胃癌组织、胃溃疡组织、正常胃黏膜中端粒酶活性和 hTRT 基因表达。【结果】58例胃癌组织中51例(88%)有 hTRT 基因表达,50例(86%)检测到端粒酶活性,58例非胃癌组织中,3例有 hTRT 基因表达,无1例检测到端粒酶活性。【结论】hTRT 基因表达与端粒酶活性的表达具有高度一致性。

端粒酶催化亚单位hTRT基因在人肝癌组织中的表达

目的探讨人端粒酶催化亚单位hTRT基因在肝癌组织中的表达情况.方法用兔抗人端粒酶催化亚单位多克隆抗体作为一抗,生物素化羊抗兔IgG作为二抗,对肝癌组织石蜡切片采用免疫组织化学方法测定hTRT基因的表达.结果 30例肝癌组织中25例检出hTRT阳性(25/30),正常肝组织无1例阳性.结论免疫组织化学法检测hTRT敏感性高、特异性强、重复性好,较其他方法简便、快速、经济且无放射性核素污染等缺点,临床具有推广价值.

人端粒酶催化亚单位基因转染人胚胎成纤维细胞后胶原的变化

目的 将重组正义hTERT基因荧光真核表达载体导入人胚胎成纤维细胞 (hEF)中 ,探讨外源性hTERT基因转染对hEF细胞胶原含量变化的影响。方法 应用脂质体法将正义重组pIRES2 -EGFP -hTERT质粒及空载pIRES2 -EGFP质粒分别转染至原代培养hEF中 ,westernblot检测转染细胞和未转染细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化 ;放免法检测转染细胞和未转染细胞培养液上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。结果 外源性hTERT基因转染细胞 (hEF -hTERT)较未转染细胞 (hEF)和空载体转染细胞 (hEF -EGFP)中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显增加 ;hEF -hTERT细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量也较hEF和hEF -EGFP细胞有显著增加。结论 外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEF细胞胶原合成增加 。

端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv—tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究

目的研究人端粒酶催化亚单位（human telomerase catalytic subunit，hTERT）基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶／更昔洛韦（herpes simplex virus-thymidine kinase／ganciclovir，Hsv-tk／GCV）治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法（1）用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的比基因表达质粒（pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk）转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5，用逆转录-PCR方法检测转染细胞中此基因的表达情况；（2）用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用；（3）用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果（1）转染pGCS-sv40-tk的细胞A549、MRG5和转染pGCS-hTp-tk的A549均有tk mRNA表达，转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tk mRNA表达；（2）GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGCS—hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用，对转染pGL3-hTp-tk的MRG-5无明显抑制作用；（3）转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞，GCV处理后细胞凋亡指数（21．58％、9．35％和23．19％）均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞（0．78％和0．55％）及空白对照A549和MRC-5细胞（2．17％和0．60％），转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数（0．88％）无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达，hTERT调控的Hsv-tk／GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因TK插入质粒pGL3--hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有TK mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达.提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件.