端粒酶反义RNA转染逆转膀胱癌T24恶性表型的研究

为了研究端粒酶反义RNA对膀胱癌T24细胞恶性表型的抑制及促进其凋亡的作用,采用脂质体转染法将能转录出端粒酶反义RNA质粒导入膀胱癌T24细胞,应用PCR-ELISA法测定转染后T24细胞的端粒酶活性;光镜、电镜、MTT法及流式细胞检测(FCM)等方法观察端粒酶反义RNA对T24细胞的生长及凋亡的影响。结果显示,端粒酶反义RNA能显著抑制T24细胞的端粒酶活性,使其生长受抑制。形态学观察转染后T24细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现细胞周期G1期前出现亚2倍体峰——凋亡峰。结论:转染端粒酶反义RNA能抑制膀胱癌T24细胞的恶性表型,并促进其凋亡,从而为以端粒酶作为膀胱肿瘤基因治疗的新靶点提供实验依据。

端粒酶反义RNA基因转染抑制裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的研究

目的 观察端粒酶反义RNA基因转染对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞生长的影响。方法将脂质体介导的端粒酶反义RNA真核表达载体 (pBBS hTR)、空载体 ( pBBS 2 12 )及生理盐水注入移植瘤体内 (每天 3 0 0 μl,共 7d) ,应用端粒酶活性聚合酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)、苏木素 伊红 (HE)染色、透射电镜等连续观察 6周移植瘤组织细胞端粒酶活性和生长变化。结果 注射转染pBBS hTR组和空载体组瘤体积抑制率分别为 48.7%和 2 .8% (P <0 .0 5 )。转染pBBS hTR组端粒酶活性降低 ,细胞生长受抑制。电镜观察见典型凋亡特征。 结论 端粒酶反义RNA基因瘤体内注射转染有效地抑制裸鼠人膀胱癌细胞生长 ,具有潜在临床应用价值。

端粒酶反义RNA影响人肝癌细胞系HepG2生长的初步报告

目的探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义。方法将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性。结果形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现G1期前出现凋亡峰,凋亡率为4·2%。在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。HepG2/pBBS212细胞的瘤体抑制率为2·4%,与HepG2/pBBS212-hTR细胞的25·6%相比,差异有显著性(P<0·05)。结论转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡。

正反义人端粒酶RNA组分(hTR)逆转录病毒真核表达载体的构建

端粒的功能是完成染色体末端的复制,防止染色体免遭融合、重组和降解,其长度的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础,而调控端粒长度的关键分子则是端粒酶.端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用.端粒酶RNA(hTR) 作为端粒酶的组成部分决定着端粒的重复序列并参与端粒酶的活化.本研究将反义端粒酶RNA基因插入到逆转录病毒质粒载体PLXSN中,构建真核表达重组质粒PLXSN-hTR,以期重组质粒表达反义端粒酶RNA,从复制、转录、及翻译三个水平发挥作用,调控肿瘤细胞的端粒长度和端粒酶的活性,抑制或逆转肿瘤细胞的恶性表型,为研究和探索基因治疗肿瘤奠定基础.

反义端粒酶RNA基因对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用

目的:研究反义人端粒酶RNA基因(human telomerase RNA,hTR)在裸鼠体内对肝癌移植瘤的抑制作用。方法:BALB/c裸鼠前肢腋窝皮下注射HepG2肝癌细胞构建移植瘤模型,以携反义hTR逆转录病毒质粒PLXSN-hTR-BamHⅠ瘤体内注射治疗(每次0.2 ml,共5次),以注射正义hTR逆转录病毒质粒PLXSN-hTR-EcoRⅠ和生理盐水为对照,测量肿瘤体积,计算抑瘤率;H-E染色观察瘤组织病理变化;TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡。结果:反义hTR治疗组肿瘤生长较正义hTR治疗组及生理盐水组明显减慢,反义hTR组抑瘤率为26.78%,明显高于正义hTR组的1.93%(P<0.01)。反义hTR治疗组较正义hTR治疗组及生理盐水组瘤组织坏死面积、肿瘤细胞凋亡率均明显增加(均P<0.01)。结论:反义hTR在裸鼠体内能够显著抑制肝癌移植瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。

端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的探讨端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法反义寡核苷酸(AS-ONS)作用于Tca8113细胞;采用MTT法测定AS-ONS对Tca8113细胞的毒性;倒置相差显微镜观察细胞生长状况及形态学改变;透射电镜观察细胞超微结构;测定Tca8113细胞端粒酶活性。结果AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,其生长抑制随剂量的增加而增强,具有浓度依赖性;AS-ONS对于Tca8113细胞端粒酶活性抑制作用具有时间依赖性。不同浓度AS-ONS作用于Tca8113细胞,其细胞毒性作用较弱;在倒置显微镜下可见AS-ONS组随药物浓度增高,细胞生长出现抑制。透射电镜观察到AS-ONS组作用的细胞细胞膜破损,细胞核内染色质凝聚,边集,并穿过核膜溢入胞质中,胞质部分溶解,线粒体空胞变性;AS-ONS对端粒酶活性抑制效果非常明显。结论反义寡核苷酸AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,并具有剂量依赖性和时间依赖性;靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸可明显地抑制Tca8113细胞端粒酶活性,细胞增殖受到明显抑制。

人反义端粒酶RNA转染SGC-7901细胞后细胞周期调控基因表达的改变

目的 :观察反义人端粒酶RNA(HumantelomeraseRNAcomponents ,hTR)转染的SGC 790 1胃癌细胞 ( 790 1 ahTR)细胞周期调控基因表达的变化。方法 采用RT PCR、Western印迹和免疫组化方法检测SGC 790 1和 790 1 ahTR细胞p2 1、p2 7、p16、c myc等基因mRNA和蛋白的表达。结果 反义hTR转染的 790 1细胞p2 1和p2 7表达增加 ,PCNA和c myc表达下调 ,而cyclinD1和p16mRNA表达无明显变化。结论 抑制端粒酶活性能调节多种细胞周期调控基因的表达 ,从而抑制肿瘤细胞的增殖和诱导分化。

反义端粒酶RNA对肝癌细胞黏附和侵袭的影响

目的:探讨人反义端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)对肝癌细胞系BEL-7402黏附和侵袭的影响及其机制。方法:利用前期实验成功转染端粒酶正、反义RNA基因的肝癌细胞,分为正义转染组(BEL-7402-hTR-EcoRⅠ细胞)、反义转染组(BEL-7402-hTR-BamHⅠ细胞),空白对照组(BEL-7402细胞)。黏附实验和侵袭实验检测反义hTR转染后BEL-7402细胞的黏附和侵袭能力,免疫细胞化学检测整合素β1(integrinβ1,INTβ1)、上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cad)的表达水平,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、-9的活性变化。结果:与空白对照组和正义hTR转染组相比,反义hTR转染组BEL-7402-hTR-BamHⅠ细胞的黏附、侵袭能力明显减低(0.204±0.029vs0.505±0.037、0.465±0.029,34.80±3.19vs71.47±5.15、69.87±3.11,均P<0.05),INTβ1表达降低(0.153±0.016vs0.385±0.008、0.375±0.014,P<0.05),E-cad表达增强(0.209±0.020vs0.124±0.018、0.134±0.016,P<0.05),MMP-2和MMP-9的活性受到明显抑制(2 054.22±138.52vs3 105.56±329.60、2 923.22±269.08,846.33±104.66vs1 538.89±122.85、1 453.33±126.35,均P<0.05)。结论:人反义端粒酶RNA能明显减低肝癌BEL-7402细胞的黏附、侵袭能力,其机制可能与上调E-cad的表达、下调INTβ1的表达,并抑制MMP-2和MMP-9的活性有关。

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响。方法 采用RT-PCH方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确。与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降。结论 本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性。

端粒酶RNA反义核酸联合其催化亚单位反义核酸对子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用

目的 探讨端粒酶RNA反义核酸 (反义hTR)联合端粒酶RNA催化亚单位反义核酸(反义hTERT) ,对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及作用机理。方法 实验分为空白对照、脂质体对照、正义hTR、正义hTERT、反义hTR、反义hTERT及反义hTR +反义hTERT组。分别采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法、PCR 端粒重复序列扩增 (TRAP) 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测宫颈癌Hela细胞转染反义hTR和反义hTERT后细胞的增殖、端粒酶活性及细胞形态学、细胞凋亡和细胞周期阻滞的变化。结果 宫颈癌Hela细胞转染端粒酶反义核酸后 ,出现明显的细胞增殖抑制、端粒酶活性下降、细胞凋亡形态学改变、细胞凋亡率升高及细胞周期阻滞。反义hTR、反义hTERT组与空白对照、脂质体对照及正义hTR、正义hTERT组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 0 1)。Hela细胞转染反义核酸 (0 2 μmol/L) 3d后 ,反义hTR +反义hTERT组 ,细胞增殖抑制率、相对端粒酶活性 (相对于空白对照组 )、细胞凋亡率分别为 6 9 3%、19 6 %、2 8 6 % ,与反义hTR组和反义hTERT组比较 ,差异均有统计学意义 (P <0 0 1) ,Q值分别为 0 86 7、0 919、1 0 75。反义hTR +反义hTERT组G0 /G1期细胞比例增加。结论 端粒酶反义核酸能通过特异性抑制端粒酶活性。

反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用

目的研究反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体对结直肠癌HT29细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用,探讨以端粒酶为靶点的结直肠癌基因治疗的可能性。方法将端粒酶hTR的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中,转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒,感染结直肠癌HT29细胞。采用RT-PCR检测hTR表达,端粒酶重复扩增法(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测端粒酶活性,绘制生长曲线了解细胞生长状态,倒置显微镜观察和DNA片段电泳检测细胞凋亡。结果反义hTR作用后的结直肠癌细胞hTR表达下降,端粒酶活性和细胞生长受到明显抑制,细胞出现凋亡。结论反义hTR对结直肠癌HT29细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制作用,有可能以hTR为靶点对结直肠癌进行基因治疗。

反义端粒酶RNA抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的 探讨人端粒酶 RNA(human telomerase RNA,h TR)反义 c DNA在体内外对胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法 将 h TR反义 c DNA作用于人胶质瘤细胞系 TJ90 5 ,用 MTT法检测细胞存活率、端粒酶重复序列扩增法测定端粒酶活性、RT- PCR法检测 h TR及其人端粒酶催化亚基 (humantelomerase reverse transcriptases,h TERT)表达、观察裸鼠体内肿瘤生长情况等检测其作用效果。结果h TR反义 c DNA在体内外明显抑制肿瘤细胞生长 ,降低端粒酶活性 ,抑制 h TR及 h TERT表达。结论h TR反义 c DNA显著抑制人胶质瘤细胞生长 ,可成为恶性胶质瘤基因治疗的靶基因。

反义hTR基因瘤内注射对荷瘤鼠肿瘤治疗作用的初步观察

目的 观察反义人端粒酶RNA(hTR)基因瘤内注射对荷瘤鼠肿瘤的治疗作用。方法 人胃癌细胞株SGC 790 1裸鼠背部皮下接种 ,成瘤后于瘤内多点注射FuGENETM6 /反义hTR表达质粒复合物 ,设FuGENETM6稀释液为对照 ,观察肿瘤生长情况和肿瘤组织学结构变化。结果 治疗组肿瘤生长速度明显减慢 ,治疗 1月后瘤体较对照组小 2 3% ,瘤组织中的瘤细胞排列较稀疏并形成较多的腺样结构 ,显示有分化倾向。结论 反义hTR基因瘤内注射对荷瘤鼠肿瘤有一定的治疗作用 ,值得进一步研究。