人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达

目的：检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后，心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化，以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达。方法：人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备。健康雄性SD大鼠90只，取12只作为假手术组，剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，结扎后24h存活36只，随机分为对照组和实验组，18只，组。造模后24h，实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0．1mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液，（2-4）×10^10L^-1细胞；对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液。应用ELⅠSA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达，RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ与端粒酶反转录酶mRNA水平。结果：①细胞移植后1，2，4周，假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化（P〉0．05）；与假手术组比较，实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低（P〈0．01），心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高，于第2周达峰值（P〈0．01），且实验组较对照组升高更为显著（P〈0．01）。②细胞移植后1，2，4周，假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达；实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ，含量显著高于其余两组（P〈0．01）。③细胞移植后第1周，实验组和对照组心肌细胞鼠胰岛素样生长因子ⅠmRNA相对表达量明显高于假手术组（P〈0．01）：至第2周实验组达峰值，显著高于对照组（P〈0．01），然后逐步下降。实验组和对照组心肌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达均逐渐呈升高趋势，且实验组更为显著（P〈0．01）。结论：人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后，能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ，明显促进心肌梗死早期大鼠心肌细胞鼠胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达，同时可持续促进心肌及全身其他组织鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌。

胃癌患者外周血人端粒酶反转录酶 基质金属蛋白酶-7 mRNA的表达及临床意义

目的应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测胃癌患者外周血中人端粒酶反转录酶(HTERT)及基质金属蛋白酶(MMP)-7mRNA的表达情况,探讨其对监测胃癌血液微转移的临床意义及其对预后的影响。方法采用Trizol法提取血液标本中的总RNA,将其反转录成cDNA,然后用RT-PCR技术检测血液标本中MMP-7mRNA和HTERTmRNA表达,计算样本的△Ct值。结果 126例胃癌患者中,HTERTmRNA阳性58例,阴性68例。MMP-7mRNA阳性46例,阴性80例。不同性别、年龄、分化程度的胃癌患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率差异无统计学意义。Ⅲ、Ⅳ期患者外周血HTERTmRNA阳性率较Ⅰ、Ⅱ期患者明显增高,差异有统计学意义。有远处转移的胃癌患者较无远处转移的患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率明显增高,差异有统计学意义。癌胚抗原阳性患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率较癌胚抗原阴性的患者明显增高,差异有统计学意义。无远处转移的胃癌患者中,HTERT、MMP-7阳性与阴性患者复发转移情况比较,检测后6、12个月HTERT阳性组较阴性组肿瘤复发转移率显著增高,差异有统计学意义。检测后12个月MMP-7阳性组较阴性组肿瘤复发转移率增高,差异有统计学意义。结论胃癌患者外周血HTERT及MMP-7mRNA表达对早期发现血液微转移及预后具有重要意义,值得进一步研究。

人端粒酶反转录酶mRNA在不同类型黑素瘤中的表达及其意义

目的：检测黑素瘤组织中人端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的表达，并分析其表达与黑素瘤类型及患者临床病理特征之间的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测64例黑素瘤组织和30例色素痣组织中hTERT mRNA表达水平；采用SPSS 17.0软件分析黑素瘤hTERT mRNA的表达与临床病理特征间的关系。结果黑素瘤组织中hTERT mRNA相对表达水平为52.43±5.42，高于色素痣组织的21.38±3.73，差异有统计学意义（t＝4.72，P＝0.000）。hTERT mRNA的表达与黑素瘤患者的年龄、性别、民族均无关（均P＞0.05），而与黑素瘤类型、淋巴结转移、Clark分级相关（均P＜0.05）。黏膜黑素瘤中hTERT mRNA表达水平高于肢端、非肢端黑素瘤（t＝7.71，P＝0.001），而肢端、非肢端黑素瘤间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论黑素瘤组织中hTERT mRNA的表达升高，其中以黏膜黑素瘤尤为显著。 hTERT可能与黑素瘤的发生、发展相关。

反转录聚合酶链式反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA

目的 研究端粒酶催化蛋白亚单位（ｈＴＥＲＴ）ｍＲＮＡ在肿瘤组织中的表达情况，建立一种恶性肿瘤诊断的新方法。方法 提取肿瘤组织总ＲＮＡ，用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法进行检测。结果７６例各型肿瘤组织中６６例阳性，５例恶性胸腹水全部阳性。结论 ＲＴ－ＰＣＲ法检测 ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ是一种灵敏、简便的恶性肿瘤辅助诊断的新方法。

端粒酶反转录酶基因在肝细胞癌中的表达及其意义

目的研究肝细胞癌中端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因的表达及其临床意义。方法采用原位杂交方法分别对肝细胞癌及肝炎后肝硬化组织中hTERTmRNA进行检测。结果肝癌中hTERTmRNA表达阳性率明显高于肝硬化组织,差别有统计学意义（P〈0.01）;中、低分化的肝癌hTERT mRNA阳性强度高于高分化者,差别有统计学意义（P〈0.05）;肝癌中hTERTmRNA表达阴性组患者术后3年生存率高于阳性组患者,差别有统计学意义（P〈0.05）;hTERTmRNA表达弱阳性的肝癌患者生存时间较强阳性者延长,差别有统计学意义（P〈0.05）。结论hTERTmRNA阳性表达普遍存在于肝癌组织中,通过检测肝癌中hTERTmRNA表达情况可用来作为肝癌诊断及预后估计的新标志物。

肝胆恶性肿瘤外周血人类端粒酶反转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的探讨肝胆恶性肿瘤外周血人端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的表达及其临床意义。方法选取本院肿瘤科经病理确诊并且未接受过放化疗的肝癌、胆囊癌及胆管癌患者各30例，术前、术后3个月及术后复发时采取外周静脉血，分离外周单个核细胞采用反转录一聚合酶链反应进行hTERTmRNA测定。同时选择同期在本院进行健康体检的30例健康志愿者作为对照。结果（1）术前健康受试者30例，肝癌患者30例，胆囊癌患者30例，胆管癌患者30例，hTERTmRNA水平分别为3．42±1．75、8．42±2．42、8．47±2．39、8．17±2．63；（2）肝胆恶性肿瘤患者外周血hTERTmRNA水平与患者的肿瘤分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关（P〈0．叭），而与性别、年龄和肿瘤类别无明显相关（P〉0．05）；（3）肝癌患者30例，胆囊癌患者30例，胆管癌患者30例，术前hTERTmRNA水平分别为8．42±2．42、8．47±2．39、8．17±2．63，术后hTERTmRNA水平分别为5．06±1．58、5．16±1.57、5．13±1．60；（4）随访时期有54例患者复发，复发患者术前和术后3个月时外周血hTERTmRNA水平均较未复发患者显著升高（P〈0．01）；（5）复发患者肿瘤复发时外周血hTERTmRNA较术后3个月时显著升高（P〈0．01）。结论肝胆恶性肿瘤患者外周血hTERTmRNA水平显著升高，并且与肿瘤的发生、发展以及患者的临床预后有关。

外周血人端粒酶反转录酶mRNA及四种肿瘤标志物检测在胃癌诊断中的价值

目的探讨外周血人端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA与肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原72-4(CA72-4)、CA19-9、CA125单项、联合检测在胃癌诊断中的应用价值。方法收集包头市肿瘤医院2017年6月至2018年10月初次诊断为胃癌的48例患者为试验组,同期50名健康体检者为健康对照组,全部受试者采集外周静脉血标本。反转录合成hTERT cDNA后,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hTERT基因段。电化学发光法检测CEA、CA72-4、CA19-9、CA125。计算各个标志物单项或联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比。对联合检测项目进行灵敏度及特异度的比较。结果外周血hTERT mRNA(P<0.01)、CEA(P=0.002)、CA72-4(P=0.003)、CA19-9(P=0.017)在胃癌组与健康对照组中的阳性率比较差异有统计学意义,而CA125阳性率在两组中差异无统计学意义(P>0.05)。hTERT mRNA表达与TMN分期、淋巴结转移及远处转移有关(均P<0.05),与年龄、性别、发生部位、浸润程度、分化程度无关(均P>0.05)。诊断指标计算结果显示,hTERT mRNA有较高灵敏度(84.8%)、特异度(82.7%)、准确度(83.7%)、阳性预测值(81.2%)、阳性似然比(4.90);CA72-4对胃癌诊断效果仅次于hTERT mRNA,其特异度(61.2%)、准确度(64.3%)、阳性预测值(45.8%)均较高。CA125、CEA、CA72-4、CA19-9、hTERT mRNA联合检测与hTERT mRNA、CEA、CA72-4、CA19-9联合检测的诊断性能相比,差异无统计学意义(P>0.05)。传统肿瘤标志物CEA、CA72-4、CA19-9联合检测时灵敏度为62.5%、特异度为80.0%,hTERT mRNA、CEA、CA72-4、CA19-9联合检测的灵敏度可提高至90.0%,特异度降低至67.5%,两种联合检测组合灵敏度改变差异有统计学意义(P=0.019),特异度改变差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血hTERT mRNA综合评价指标优于传统胃癌标志物,有望成为诊断胃癌的一种新型标志物。

结直肠癌患者人类端粒酶反转录酶mRNA的表达及影响因素

目的观察结直肠癌患者人类端粒酶反转录酶（hTERT） mRNA的表达，并分析其影响因素。方法分析在我院接受治疗的80例结直肠癌患者，同时选取80例健康成年人的临床资料作为对照。观察两组患者结直肠组织hTERT mRNA表达，比较不同临床病理特征的结直肠癌患者结直肠组织hTERT mRNA的表达，分析影响结直肠癌患者hTERT mRNA表达的影响因素。结果结直肠癌患者的结直肠组织hTERT mRNA阳性表达率为87.50%，明显高于正常对照组（6.25%）；有腹腔淋巴结转移、组织学分型为管腺癌、TNM分期为Ⅲ＋Ⅳ期、分化程度为中低分化的结直肠癌患者其结直肠组织hTERT mRNA阳性表达率较高（χ2＝4.068、4.898、8.447、6.154；P＝0.044、0.027、0.004、0.013），而不同年龄、性别、肿瘤部位和大小的结直肠癌患者结直肠组织hTERT mRNA阳性表达率比较，差异无统计学意义（χ2＝2.593、0.258、0.878、0.152、1.755；P＝0.107、0.612、0.349、0.696、0.185）；有无腹腔淋巴结转移、组织学分型是影响结直肠癌患者结直肠组织hTERT mRNA阳性表达率的危险因素，其比值比（OR）分别为4.115和3.985。结论结直肠癌患者结直肠组织hTERT mRNA的阳性表达率较高，且与患者是否存在淋巴结转移、肿瘤分期和组织分型密切相关。

树突状细胞与自然杀伤细胞共同作用对人黑色素瘤A375细胞端粒酶反转录酶mRNA的间接影响

目的 观察树突状细胞（DC）与自然杀伤（NK）细胞体外共同作用对人黑色素瘤A375细胞人端粒酶反转录酶（hTERT） mRNA的影响.方法 从健康人外周血中获得DC、NK细胞,在transwell培养体系中用DC、NK细胞单独或共同作用的微环境作用A375细胞,采用反转录PCR检测A375细胞hTERT mRNA表达的变化.结果 transwell下室的DC与NK细胞单独或共同作用均能间接抑制上室A375细胞hTERT mRNA的表达,DC联合NK细胞的抑制作用更强,且对A375细胞hTERTmRNA的抑制具有时间依赖性.结论 DC、NK细胞能间接抑制人恶性黑色素瘤A375细胞hTERTmRNA的表达,DC和NK共同作用有更强的抑制作用.

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成。材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6/V5-DEST,ccdBSurvival,Stbl3及293FT细胞由暨南大学生物工程研究所提供。方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点HindⅢ,BgⅢ),通过酶切及连接反应形成pDONR221-hTERT-EGFP。采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞。主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功。包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况。结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP成功构建。转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法。

miR-1182调控胃癌细胞人端粒酶反转录酶的分子机制及其对迁移能力的影响

目的研究miR-1182在胃癌细胞中调控人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的机制及对其迁移能力的影响。方法胃癌细胞MKN28中转染miR-1182类似物,qRT-PCR检测转染后细胞miR-1182的相对表达量,Western blot检测转染后细胞hTERT的表达变化;进一步通过生物信息学预测miR-1182与hTERT mRNA的结合位点,双荧光素酶实验分析miR-1182对hTERT mRNA的作用机制;Transwell实验检测转染miR-1182类似物对MKN28细胞体外迁移能力的影响。结果 qRT-PCR表明miR-1182组的miR-1182的相对表达量(10.168±2.645)明显高于对照组(1.008±0.167)(P<0.01)。Western blot结果显示在胃癌细胞系中过表达miR-1182后,hTERT的蛋白水平下调。双荧光素酶实验表明miR-1182可与hTERT mRNA的ORF区结合,且其主要结合部位为hTERT mRNA的ORF-1;在Transwell迁移实验中,miR-1182类似物转染细胞后,miR-1182组穿膜细胞数为(23.333±4.509)/视野,对照组穿膜细胞数为(71.000±4.582)/视野,miR-1182组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.01)。结论 miR-1182通过与胃癌细胞hTERT的ORF区结合,从而在转录后水平抑制hTERT的表达,并发现其可抑制胃癌细胞的迁移能力。

反转录聚合酶链反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA

为研究端粒酶催化蛋白亚单位(caltalytic protein subunits of telomerase,hTERT)mRNA在肿瘤组织中的表达情况,建立一种恶性肿瘤诊断的新方法,通过提取肿瘤组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法对76例各型肿瘤组织及5例恶性胞腹水进行了检测。结果表明,76例各型肿瘤组织中66例阳性,5例恶性胸腹水全部阳性,表明RT-PCR法检测hTERTmRNA是一种灵敏、简便的恶性肿瘤诊断的新方法。

端粒酶反转录酶活化与p53金属蛋白酶-9表达对非小细胞肺癌发生的影响

目的探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)、p53、金属蛋白酶-9(MMP-9)与非小细胞肺癌(NSCLC)发生的内在联系及其作用。方法应用原位杂交、HE及免疫组织化学技术对104例NSCLC组织进行检测,探讨NSCLC发生的分子机制及诊断的可能性。结果(1)hTERT mRNA、p53、MMP-9在NSCLC中均有较高的表达,阳性率分别为73.08%,69.23%,84.62%。(2)hTERT mRNA在鳞癌中表达为64.71%,腺癌中为88.89%(2χ=6.997,P<0.01)。(3)p53与hTERT mRNA阳性表达呈正相关性(r=0.651,P<0.05),二者的阳性共表达为53.85%,一致性表达为65.40%。p53与MMP阳性表达呈正相关性(r=0.477,P<0.05),二者的阳性共表达为53.85%,一致性表达为53.85%。hTERT mRNA与MMP-9阳性表达呈正相关性(r=0.671,P<0.01),二者阳性共表达率为71.15%,一致性表达率为75.00%。结论p53、hTERT mRNA、MMP-9具有协同促进NSCLC发生的作用;hTERT mRNA的表达与NSCLC的类型有关。

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的:观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶(hTERT)表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法:以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2 h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48 h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果:榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论:榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。

人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细胞的生物学特性

目的:研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性,包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法:收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB),绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征,软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验检测Clone5是否恶性变。结果:由生长曲线计算出细胞倍增时间:hOB:190h;Clone5:62h;曲线显示Clone5的增殖能力明显增强;流式细胞仪检测发现,Clone5细胞周期中G1期细胞占53.46%,S期细胞占28.24%,凋亡率为0.76%,hOBG1期细胞占79.81%,S期细胞占19.76%,凋亡率为33.33%。和hOB相比,Clone5G1期细胞比例减少,S期比例增加,细胞的凋亡率显著降低;软琼脂集落实验未见细胞团形成,裸鼠接种不致瘤。结论:转导hTERT基因的Clone5增殖能力明显增强,凋亡率降低,且未发生恶性变,可用做组织工程的种子细胞和研究正常骨生理、生化的工具细胞。

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响。方法将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只。对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合。建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃。于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量。结果建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.