人端粒酶启动子(hTERTp)真核表达载体的构建

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子,构建真核表达载体pEGFP-hTERT。方法以人类基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增hTERT上游序列长约1135 bp的启动子片段,克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游,测序鉴定。结果DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,片段长度为1135 bp。结论人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP-hTERT构建成功,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。

影像组学结合深度学习预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子状态

目的 探讨基于MRI的影像组学和深度学习建立融合模型预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)突变状态。资料与方法 回顾性分析2019年1月—2021年6月重庆医科大学附属第一医院癌症基因组图谱和癌症影像档案的175例异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤患者(训练组122例,测试组53例),评估其TERTp突变状态。在T1c和T2f图像上勾画水肿区和肿瘤区,使用SE-Net模型构建深度学习模型,提取不同区域(水肿区、肿瘤区和整体病变)的组学特征,并通过最小绝对收缩和选择算法筛选11个特征建立组学模型。最后,将影像组学模型、深度学习模型和包含伦勃朗视觉感受图像特征的临床模型结合为融合模型,使用校准曲线和决策曲线评估模型。结果 最终建立6个预测模型,临床模型训练组和测试组曲线下面积(AUC)分别为0.815(95%CI 0.738~0.892)和0.645(95%CI 0.494~0.796);深度学习模型训练组和测试组AUC分别为0.860(95%CI 0.798~0.922)和0.735(95%CI 0.614~0.856);融合组学模型比单独水肿或肿瘤区组学模型预测性能更优,训练组和测试组AUC分别为0.906(95%CI 0.856-0.955)和0.867(95%CI 0.769~0.964);融合模型预测性能最佳,训练组和测试组AUC分别为0.964(95%CI 0.929~1.000)和0.905(95%CI 0.818~0.991)。结论 影像组学结合深度学习的临床融合模型在预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的TERTp突变状态方面表现良好。

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析(英文)

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实.然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268bp～-10bp)的3′端接入3个E-box序列,构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子.然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达.结果表明,在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组(P<0.01);而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组(P<0.01);在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P>0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.

人甲状腺鳞癌细胞中端粒酶启动子功能分析

目的观察不同长度的人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子对启动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能力的差异,评价启动子启动功能与长度的关系。方法克隆4段不同长度的端粒酶基因起始位点(ATG)上游序列长约2 068、1 135、333和142 bp的启动子片段,通过观察EGFP的荧光强度,确定启动效率。结果显微镜观察荧光亮度及荧光分光光度计检测荧光强度随着启动子长度的缩短而减弱,荧光强度由高至低依次为8.56,7.81,6.88,3.62。结论人端粒酶的表达强度及端粒酶的活性变化与其启动子的长度有关,而肿瘤细胞的端粒酶表达相对增强,可通过下调启动子活性,为肿瘤的靶向性基因治疗提供新思路。

端粒酶启动子肿瘤靶向基因抗大肠癌的研究

目的探讨端粒酶 (hTERT)启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducingligand ,TRAIL)基因在大肠癌细胞DLD1的表达及肿瘤杀伤作用。方法通过腺病毒载体系统将hTERT启动子驱动的TRAIL基因转入大肠癌细胞DLD1,流式细胞仪检测GFP/TRAIL的表达和DLD1细胞凋亡率。结果端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL基因和CMV启动子驱动的GFP(绿色荧光蛋白 )基因在DLD1内的表达率分别达 4 1 6 3%和 5 4 0 7% ;GFP/TRAIL基因对DLD1细胞的生长抑制率和凋亡率分别达 93 5 0 %和 5 6 97% ,与PBS和Ad/hTERT LacZ的差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL融合基因在大肠癌细胞中能够有效地表达 ;TRAIL基因对大肠癌细胞DLD1有明显的抑制生长和促凋亡作用。

端粒酶启动子突变对EGFP启动效率影响

目的观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)的突变启动子启动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)发光强度的变化情况。方法应用PCR引入突变方法获得hTERT上游序列长约300bp的启动子片段,包括单增强子(E-box)突变序列(2个);双E-box突变序列;单转录因子特异蛋白1(Sp1)结合位点突变序列(5个);Sp1结合位点全部(Sp1-5)突变序列,分别克隆入无启动子的绿色荧光蛋白EGFP的基因上游,稳转入SW579细胞中,观察细胞EGFP的发光强度。结果除了约-110bp的单Sp1突变对EGFP的启动效率影响不大之外,任何一种E-box或Sp1突变的启动子均显示启动效率不同程度的下降,其中双E-box突变的启动子和5个SP1结合位点均突变的启动子启动绿色荧光蛋白的表达强度明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论转染人端粒酶启动子突变基因,能够抑制SW579细胞EGFP的发光效率,证明人端粒酶启动子的E-box序列、SP1结合序列对启动子的启动效率密切相关,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗提供了基础依据。

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 。

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法:建立人膀胱癌细胞株253JBALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果。通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P<0.05),抑瘤率明显。Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组。结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著。

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一.端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶(hTERT)维持端粒长度.由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点.我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展.

人端粒酶逆转录酶基因启动子介导重组Caspase-3治疗人肺腺癌的研究

目的探讨使重组Caspase-3分子选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡从而杀伤肿瘤细胞的可行性。方法构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控下的重组Caspase-3分子,通过报告基因分析、Caspase-3酶活性分析、流式细胞分析、MTT方法和动物实验来研究其在肿瘤细胞中选择性诱导凋亡的作用。结果通过Caspase-3酶活性分析,发现phTERT-Rev-Caspase-3在人肺腺癌细胞A549中能够诱导Caspase-3的活性表达;流式细胞分析和MTT方法提示其具有明显的诱导A549细胞凋亡、抑制增殖的作用;动物实验显示其能够有效地抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长。结论phTERT-Rev-Caspase-3是一种有效的选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡的分子。

端粒酶逆转录酶启动子hTERT／U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建有hTERT/U6嵌合启动子的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)表达载体,并用分子生物学的技术和方法验证其对肝癌细胞SMMC-7721的效应。方法构建siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体,将其转染到稳定表达EGFP的肝癌细胞株7721(EGFP-7721),观察细胞荧光的变化及RT-PCR,Western blot筛选出更有效的siRNA-EGFP-PTZU6+1载体。PCR扩增端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase promoter,hTERT)启动子的核心序列,构建针对EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达载体(EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT),正向和反向插入的hTERT启动子各1个,并将其转染至EGFP-7721细胞中,RT-PCR验证其效应。结果RT-PCR,Western blot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后EGFP基因的表达无统计学差异,但与对照组比较均显著抑制了EGFP基因(P<0.01)。而且,RT-PCR结果显示,反向插入的重组质粒EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT与对照组相比显著抑制了EGFP基因的表达(P<0.05)。结论构建的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体在肝癌细胞中具有功能活性,为探讨基因的靶向治疗奠定了基础。

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子(hTERT)调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体,并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法:利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用G418筛选获得阳性克隆;应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术(FCM)结合间接免疫荧光、RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果:经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论:成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体,并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建

目的构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerasereserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体。方法提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子。并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达。结果HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性。结论hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径。

人端粒酶逆转录酶启动子转录活性的磁共振成像研究

目的探索磁共振成像技术检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子靶向转录活性的可行性。方法构建慢病毒Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro和对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro载体,将上述载体分别转染端粒酶阳性的肺腺癌(A549)和端粒酶阴性的原代人牙周膜成纤维(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)细胞。进行免疫荧光染色和Western blot检测细胞Fth-flag表达情况,采用普鲁氏蓝铁染色检测细胞摄铁量,MR扫描观察细胞T*2WI信号和T*2值改变。结果 A549细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,免疫荧光染色和Western blot检测结果显示转染细胞表达Fth-flag蛋白,未转染细胞不表达Fth-flag蛋白,普鲁氏蓝铁染色示转染细胞摄铁量较未转染细胞显著增加,MR扫描显示转染细胞T*2WI信号(1 340.86±49.21)和T*2值(12.10±0.92)较未转染细胞(2 049.08±87.58),(21.44±1.15)显著降低(P<0.05);HPDLFs细胞转染Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro载体后,细胞无Fthflag蛋白表达,细胞摄铁量较未转染细胞无变化,T*2WI信号(2 225.42±73.43)和T*2值(24.01±1.13)较未转染细胞T*2WI信号(2 148.48±54.74)和T*2值(23.39±1.72)无显著差异(P>0.05)。而转染对照Lenti-CMV-Fth-flag-Puro慢病毒载体后,A549和HPDLFs细胞均表达Fth-flag蛋白,转染细胞摄铁量较未转染细胞均显著增加,转染细胞T*2WI信号[A549:(1 137.38±60.59),HPDLFs:(1 299.16±53.42)]和T*2值[A549:(9.61±1.17),HPDLFs:(11.54±0.74)]均比未转染细胞显著下降(P<0.05)。结论 MR铁蛋白报告基因成像技术可用于检测hTERT启动子转录活性,构建的慢病毒载体有望为恶性肿瘤的靶向诊断提供一种新的方法。

甲状腺乳头状癌端粒酶逆转录酶启动子突变的临床及超声特征分析

目的:探索与端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变相关的特征性甲状腺乳头状癌(PTC)的超声特征。方法:选取医院收治的552例术后诊断为PTC患者,依据术后分子学检测将其分为TERT组(19例,TERT启动子突变)和BRAF基因组(533例,单纯BRAF基因突变)。根据术后病理确定淋巴结转移和脉管转移的情况,超声采集结节最大径线、结节数量、回声、边缘、成分、方位、微钙化及桥本氏甲状腺炎背景等特征。比较两组TERT启动子和BRAF基因的突变率和淋巴结转移及脉管转移的发生率;将两组有差异的临床和超声特征进行Logistic回归分析,分析与TERT启动子突变的相关危险因素。结果:552例患者平均年龄为(45.39±12.39)岁,TERT组患者的平均年龄为(57.42±12.41)岁,高于BRAF基因组患者的平均年龄(44.96±12.18)岁,差异有统计学意义(t=4.378,P<0.05),TERT组中≥45岁的患者占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(48.2%),差异有统计学意义(x^(2)=6.931,P<0.05)。TERT组中有36.8%的患者发生侧颈区淋巴结转移,明显高于BRAF基因组(8.1%),差异有统计学意义(x^(2)=18.985,P<0.05)。TERT组的结节最大径(2.50±1.88)cm明显大于BRAF基因组的结节最大径(1.02±0.64)cm,差异有统计学意义(t=3.406,P<0.05)。TERT组>1 cm的结节占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(32.7%),差异有统计学意义(x^(2)=17.655,P<0.05),TERT组中囊实性结节的占比(10.5%)明显高于BRAF基因组(1.1%),差异有统计学意义(x^(2)=11.351,P<0.05)。TERT组中73.7%的患者结节距离被膜<2 mm,明显高于BRAF基因组,差异有统计学意义(x^(2)=4.621,P<0.05)。Logistic回归分析显示,相对于BRAF基因组,年龄≥45岁、结节最大径>1 cm和结节成分呈囊实性是与TERT启动子突变相关的独立危险因素(OR=3.895,OR=6.442,OR=7.929;P<0.05)。结论:在结节有垂直位、微钙化、边缘不规则等恶性征象的基础上,当患者年龄≥45岁、结节>1 cm和结节成分呈囊实性时应考虑存在TERT启动子突变的可能。

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp。方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-TEasy载体和重组载体pEGFP-C3上。经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:成功扩增出276bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致。重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达。结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达。

荧光聚合酶链反应–毛细管电泳法与Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶基因启动子突变状态对比分析

目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致性,为临床检测提供方法学依据。方法收集2017年11月至2019年11月首都医科大学宣武医院265例胶质瘤标本及临床病理资料,分别采用Sanger测序法与荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变。结果TERT基因启动子突变与年龄、组织学分型和WHO分级均显著相关(P<0.05)。Sanger测序法与荧光PCR-CE法的TERT基因启动子突变检出率分别为52.8%(140/265)及51.3%(136/265),敏感度和特异度分别为96.4%和99.2%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.955)。Sanger测序法检出TERT C228T突变103例(38.9%),荧光PCR-CE法检出99例(37.4%),敏感度和特异度分别为95.2%和99.4%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.952)。Sanger测序法和荧光PCR-CE法均检测出TERT C250T突变37例(14.0%),符合率为100.0%,具有较高一致性(Kappa=1.000)。结论荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变率与Sanger测序法相当,敏感度、特异度及一致性均较高,且操作相对简便快速。

人端粒酶反转录酶启动子调控的肿瘤特异性载体的构建及表达

目的构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的绿色荧光蛋白质粒。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒(hTERTp-EGFP)。用脂质体转染法将hTERTp-EGFP质粒分别转染至肿瘤细胞和正常细胞,观察此两种细胞内绿色荧光蛋白的表达差异。结果成功构建重组质粒hTERTp-EGFP,转染结果显示该质粒在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中无明显表达。结论重组质粒hTERTp-EGFP具有肿瘤特异性表达能力。

端粒酶催化亚基启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

近年来,端粒酶是肿瘤研究领域的热点之一,是一种核糖核酸蛋白体复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。端粒酶的活性主要是受人端粒酶催化亚单位基因的转录调控,而人端粒酶催化亚单位基因的转录主要受其启动子的调控。因此,人端粒酶催化亚单位启动子介导的使抗肿瘤基因在肿瘤细胞内靶向表达的基因治疗是肿瘤基因治疗的热点。本文对此进行了综述,旨在为肿瘤的基因治疗提供新思路。

hTERT启动子驱动的TRAIL诱导宫颈癌细胞的凋亡作用

目的:探讨端粒酶(hTERT)启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对宫颈癌细胞生长抑制的作用。方法:脂质体转染将hTERT-TRAIL转染至宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测TRAILmRNA的表达;通过MTT、流式细胞术检测稳定转染细胞的生长情况,电镜观察转染细胞的超微结构。结果:转染真核表达载体hTERT-TRAIL组细胞中TRAILmRNA细胞表达量高于对照组(P<0.05);hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的抑制率高于CMV-TRAIL组和对照组(P<0.05);hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的凋亡率明显高于转染CMV-TRAIL组和对照组(P<0.01);电镜结果显示,hTERT-TRAIL对细胞作用是以细胞凋亡为主。结论:hTERT启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人宫颈癌细胞的生长有明显的抑制作用和诱导凋亡作用,为宫颈癌的研究奠定基础和临床治疗提供思路。