端粒酶的调节基因TRAP在皮肤基底细胞癌中的表达及意义

目的:探讨端粒酶的调节基因TRAP在皮肤基底细胞癌中的表达情况。方法:用免疫组化S-P法检测TRAP在38例皮肤基底细胞癌、15例正常皮肤中的表达。结果:TRAP在皮肤基底细胞癌的表达高于正常皮肤(P<0.01);在未分化型与分化型基底细胞癌表达的差异无统计学意义。结论:TRAP的异常高表达可能与皮肤基底细胞癌的发病有关。TRAP的表达与基底细胞癌的病理分型无关。

端粒酶调节相关基因TRAP与肿瘤生物学特性的关系

目的 :研究TRAP基因在人肿瘤组织中的表达及其与人端粒酶逆转录酶 (hTERT)的作用相关性 ,探讨其在人肿瘤发生中的作用。方法 :通过原核表达TRAP蛋白免疫新西兰白兔 ,制备特异性多克隆抗体 ;免疫组化检测TRAP及hTERT在人肿瘤组织中的表达 ;通过构建TRAP真核表达载体、基因转染 ,观察TRAP对细胞hTERT转录、端粒酶活性和癌细胞生长及成瘤性的影响。结果 :通过大肠杆菌表达的TRAP蛋白免疫、制备多克隆抗体 ,经Westernblot鉴定与TRAP具有特异结合性 ;免疫组化显示 2 4 7例恶性肿瘤中有 2 13例TRAP阳性 ,表达率为 86 .2 % ,而在所有癌旁组织中TRAP为阴性。另外 ,交界性及癌前病变与良性病变组织中TRAP表达差异也有显著性。进一步检测卵巢生发上皮肿瘤、乳腺癌、肝癌及中枢神经系统肿瘤组织hTERT表达 ,显示hTERT与TRAP表达的结果相一致。TRAP正义转染使hTERT及端粒酶活性升高 ,细胞增殖加快 ;而反义转染时 ,两者均下降 ,细胞增殖受抑。裸鼠成瘤性实验表明 :正义TRAP使癌细胞成瘤性增强 ,而反义则抑制移植瘤的生长。结论 :TRAP表达存在于人癌组织及部分癌前病变 ,与癌细胞恶性表型相关 ,并与hTERT表达一致。TRAP基因参与对端粒酶的调节作用 ,可能与人肿瘤发生有关。

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。

trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型,二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱,实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平,CLUSTAL X对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析,Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC 35984株与不形成生物膜的ATCC 12228株生长中期的蛋白质组,发现ATCC 35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC 12228株。转录水平的检测显示ATCC 12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录,但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后,RNAⅢ的转录明显降低,trap基因的转录无变化。RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加,trap基因转录保持不变。trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守,但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中,trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性;并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物;表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之间存在差异,可能与其功能差异相关。

脑膜瘤中端粒酶活性的检测及其相关基因的表达

目的 研究脑膜瘤组织中端粒酶的活性及其相关基因端粒重复结合因子1、2（telomererepeat binding factor 1、2, TRF1、TRF2）、端粒酶相关蛋白1（telomerase associated protein 1, TP1）、端粒酶逆转录酶亚基（telomerase reverse transcriptase subunit, TRT）的表达,为临床诊断和治疗开拓新思路。方法 用改良端粒重复序列扩增（TRAP）法检测40例脑膜瘤的端粒酶活性,用免疫组化法检测TRF1、TRF2、TP1、TRT蛋白的表达。结果 脑膜瘤组织中端粒酶阳性率为42.5％,端粒酶阳性率和活性水平随肿瘤恶性度增加而升高。TP1、TRT表达水平和肿瘤恶性度呈正相关。TRF1、TRT2表达水平和肿瘤恶性度呈负相关。结论 端粒酶活性及TRT表达与脑膜瘤恶性度密切相关,TRT是端粒酶活性水平调节的关键。

T-STAR基因对结肠癌细胞系HCT-116端粒酶活性的影响

目的:通过正、反义T-STAR(testis—signaltransduc—tionandactivatorofRNA)基因转染结肠癌HCT-116细胞,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法:用脂质体Lipofectamine法将正、反义T-STAR基因转染入HCT-116细胞,用RT—PCR及Westernblot方法检测该细胞T—STAR基因mRNA和蛋白表达变化,并用PCR—ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果:在T—STAR转染的结肠癌HCT-116细胞中,T—STARmRNA和蛋白表达显著增加(分别为296%,180%,P<0.01),端粒酶活性明显升高;而在反义T—STAR转染的细胞中,T—STARmRNA和蛋白表达显著下降(分别为59%,83.8%,P<0.01),端粒酶活性明显降低.转染空白载体和未转染细胞中T—STAR表达极端粒酶活性无显著性差异.结论:结肠癌HCT-116细胞T—STAR基因可能参与细胞端粒酶活性的正相调节.

针刺足三里对端粒酶基因敲除小鼠免疫细胞因子表达影响的研究

目的:观察针刺足三里对端粒酶基因敲除小鼠免疫功能的影响。方法:将经聚合酶链式反应鉴定基因型后的端粒酶基因敲除小鼠,且月龄为3个月的纯合子型端粒酶基因敲除小鼠随机分为空白组、足三里组和非经非穴组,每组6只,共18只,空白组仅给予抓取动作,足三里组和非经非穴组采用针刺干预。指标检测采用细胞因子芯片技术检测小鼠血清中IL-6、IP-10、MCP-1、KC等的达水平。结果:针刺组细胞因子IL-6表达大于空白组(P<0.05);针刺足三里组细胞因子IP-10表达升高(P<0.05);针刺足三里mcp-1表达没有变化,非穴组表达下降(P<0.05);针刺足三里组细胞因子KC表达下降(P<0.05);以上具有统计学意义。针刺足三里组、非穴组和空白组细胞因子IFN-γ及G-CSF(P>0.05),无统计学意义。结论:针刺足三里对端粒酶基因敲除小鼠血清中的细胞因子IL-6、IP-10、MCP-1、KC存在调节作用。

c-myc 调节人端粒酶逆转录酶启动子活性的体外研究

目的研究c-myc对人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的调节作用.方法采用Lipofect脂质体转染法将DNA质粒分别转染至肿瘤细胞、猴肾COS-7细胞和NIH3T3细胞,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性.结果载有hTERT800bp启动子的质粒TERTLuc(800)在肿瘤细胞HepG2中活性显著增强,比对照质粒pXP高11.7倍,而在正常细胞3T3中未见表达.外源性转录因子c-myc可显著上调hTERT启动子的表达,其激活作用与剂量呈正相关.人工突变c-myc结合位点明显降低hTERT启动子的活性,下调作用达46%;外源性c-myc对其结合位点突变的hTERT启动子无明显上调作用.结论c-myc可直接激活hTERT启动子的表达,是调节端粒酶活性的重要转录因子.

trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节（agr）系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型，二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱，实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平，CLUSTALX对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析．Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC35984株与不形成生物膜的ATCC12228株生长中期的蛋白质组，发现ATCC35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC12228株。转录水平的检测显示ATCC12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录，但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后，RNAⅢ的转录明显降低，trap基因的转录无变化．RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加，trap基因转录保持不变．trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守，但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中，trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性；并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物；表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之问存在差异，可能与其功能差异相关。

端粒酶与肿瘤

0 引言 目前端粒酶的调节及其在肿瘤发生发展中的作用已成为生命科学研究的一个热点.本文总结了近几年来有关端粒酶活性调节机制及其在肿瘤发生发展中作用的研究进展.

端粒酶在恶性肿瘤诊断中应用的研究

长期以来普遍认为恶性肿瘤是由破坏细胞正常生长调节的多种基因突变引起的，但随着对恶性肿瘤发病机制研究的深入，发现端粒酶的激活是恶性肿瘤发生的先决条件。

Sp1对HL-60细胞人端粒酶逆转录酶表达的调控

目的:探讨Sp1转录因子在人白血病细胞株HL-60中对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响。方法:电泳迁移率分析(EMSA)hTERT启动子区(-116～-88 bp)是否存在Sp1结合位点。RT-PCR检测经普卡霉素处理的细胞hTERTmRNA表达。结果:hTERT启动子序列(-116～-88 bp)与核蛋白作用,出现DNA-核蛋白结合条带,普卡霉素抑制Sp1与此序列结合。普卡霉素浓度依赖性下调hTERT mRNA表达,200 nmol/L组和100 nmol/L组均明显低于50 nmol/L组、25 nmol/L组和对照组(P<0.01)。结论:Sp1与hTERT启动子区(-116～-88 bp)结合,转录激活hTERT表达。

端粒酶与卵巢功能

端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用,与卵巢卵母细胞及颗粒细胞等的增殖分化、凋亡及激素分泌有着密切关系。为说明端粒酶与卵巢功能调节之间的密切关系,指导药物通过干预端粒酶活性来调节卵巢功能的应用,对其在卵巢中的表达、与甾体激素的关系、在卵泡发育及闭锁中的作用、其活性表达的调节以及临床中的应用做一综述。

SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性

目的采用实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQ-TRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果。结果 RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为98.92%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性(r2=0.762 5)。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论 RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

脑肿瘤p53蛋白和端粒酶活性表达及临床意义的研究

目的 :探讨p53基因蛋白产物和端粒酶活性在脑肿瘤中的表达情况及其相关性 ,和两者与脑肿瘤的病理类型、恶性程度之间的关系。方法 :采用免疫组化SABC法和改进的TRAP银染法对 4 8例脑肿瘤及 10例正常脑组织中p53蛋白和端粒酶活性进行检测。结果 :脑肿瘤中p53蛋白表达检测结果为70 8% (34/ 4 8) ,端粒酶活性检测结果为 77 1% (37/ 4 8) ,正常脑组织中两者均呈阴性表达。其中 2 9例脑肿瘤端粒酶活性与p53蛋白均有表达。结论 :p53和端粒酶参与脑肿瘤的发生发展 ,p53蛋白和端粒酶活性表达与脑肿瘤的病理类型、恶性程度密切相关 ,有可能成为恶性肿瘤的重要相关标志物 ,脑肿瘤中p53蛋白与端粒酶活性表达无相关性。

皮肤鳞状细胞癌组织中TRAP的表达分析

目的：探讨端粒酶的调节基因TRAP在皮肤鳞癌中的表达情况。方法：用免疫组化s—P法检测TRAP在58例皮肤鳞癌、15例正常皮肤中的表达。结果：TRAP在皮肤鳞癌的表达明显高于正常皮肤（P〈0．01），在高、中、低三组不同分化的皮肤鳞癌的差异有统计学意义（P〈0．01），在高分化鳞癌与中分化鳞癌间的差异无统计学意义，而低分化鳞癌分别与高分化鳞癌和中分化鳞癌间的差异有统计学意义。结论：TRAP的异常高表达可能与皮肤鳞癌的发病有关，也与皮肤鳞癌的分化程度、恶性程度有关。

稳定转染ShRNA-TRAP对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响

目的探讨稳定转染靶向端粒酶调节相关基因TRAP的小发夹RNA对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建特异性作用于TRAPmRNA的小发夹RNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选的阳性克隆细胞继续压力培养3个月,采用RT-PCR法检测TRAPmRNA的表达,MTT法检测细胞生长,同时检测细胞凋亡、hTERTmRNA、端粒酶活性。结果稳定转染ShRNA-TRAP后,SGC-7901细胞的TRAPmRNA表达明显下降,hTERTmRNA和端粒酶活性降低;细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增加。结论ShRNA-TRAP能长效的抑制TRAPmRNA的表达,下调hTERTmRNA转录及端粒酶活性,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,可作为抑制端粒酶的肿瘤基因治疗策略的补充。

hTERT的转录调节的研究进展

人肿瘤细胞的显著特征是永生化生长,永生化生长与端粒酶保持端粒长度有关。正常细胞与肿瘤细胞hTERT(human telomerase reverse transcriptase)的转录调节主要机制分别通过端粒酶活性的负、正反馈调节。hTERT启动子通过细胞和病毒的因素及途径参与细胞衰老、永生化及癌变。hTERT启动子活性受致癌基因、抑癌蛋白的直接调节或通过信号转导调节。病毒基因整合在hTERT位点可导致hTERT激活、诱导端粒酶产生。

细胞外调节蛋白激酶在雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖中的作用

目的:探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)在雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖、细胞周期转化中的作用及机制。方法:以雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,MTT法检测17β-雌二醇(17β-E2)对MCF细胞增殖的影响,确定实验处理用浓度;MTT法检测PD98059对17β-E2促MCF-7细胞增殖作用的影响,求取其中效抑制浓度;流式细胞术检测细胞周期;TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性,Western印迹法检测p-ERK1/2、野生型p53蛋白水平;RT-PCR检测野生型p53 mR-NA水平。结果:ERK磷酸化抑制剂PD98059能抑制17β-E2对MCF-7细胞的促增殖作用,具有时效-量效关系,其差异具有显著统计学意义(P<0.01),各作用时间点PD98059中效抑制浓度分别为89.28μmol/L.24 h、39.81μmol/L.48 h、21.87μmol/L.72 h。应用PD98059 48 h后,能抑制17β-E2促进MCF-7细胞周期转化作用,使G1期细胞增加,S期和G2期细胞减少(P<0.01);阻抑17β-E2增强MCF-7细胞端粒酶活性的作用(P<0.05);增强野生型p53蛋白表达和p53基因转录水平(P<0.01);p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:ERK在17β-E2促乳腺癌细胞MCF-7增殖、细胞周期转化中具有重要的作用,其机制与野生型p53转录和端粒酶活性改变有关。

端粒酶转录酶及其调节相关蛋白与增殖细胞核抗原在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义

目的 探讨端粒酶转录酶 (hTERT)及端粒酶调节相关蛋白 (TRAP)与增殖细胞核抗原(PCNA)在卵巢上皮性肿瘤中的表达和临床意义。方法 收集 10 6例卵巢上皮性肿瘤 (恶性 5 4例 ,交界性 33例 ,良性 19例 )的临床资料 ,行hTERT、TRAP和PCNA 3种抗体的免疫组织化学标记链霉素卵白素生物素 (LSAB)法染色。对 87例恶性和交界性患者进行了随访 ,4 5例获结果 ,随访时间为 2～6 0个月。结果 hTERT蛋白的表达在良性 (4/ 19)和交界性 (90 9% ,30 / 33)以及良性和恶性(94 4 % ,5 1/ 5 4 )间的差异均有显著性 (P均 <0 0 0 1) ,TRAP蛋白的表达在良性 (4/ 15 )和恶性(77 8% ,2 8/ 36 )间的差异有显著性 (P <0 0 0 1) ;hTERT和TRAP蛋白的表达在卵巢癌Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期两组病例中的差异均无显著性 (P >0 0 5 ,P >0 3)。PCNA的表达在良性 (6 9± 5 9) %和交界性 (2 6 4± 17 8) %、良性和恶性 (5 1 8± 2 2 1) %以及交界性和恶性间的差异均有显著性 (P <0 0 1,P <0 0 0 1,P <0 0 5 )。 33例交界性患者全部存活 ,5 4例恶性患者中 35例 (6 4 8% )有转移 (包括 5例淋巴结转移 ) ,4例 (7 4 % )死亡。结论 hTERT和TRAP蛋白的表达与卵巢上皮性肿瘤的良恶性有关 ,但与其临床分期无关 ;