小鼠端粒酶蛋白亚单位重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建小鼠端粒酶蛋白亚单位(mousetelomerasereversetranscriptase,mTERT)基因重组腺病毒载体,为下一步研究其体外表达和动物实验研究提供基础。方法从肝癌细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增mTERT的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pAC,将此表达质粒与腺病毒重组质粒pJM17共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒载体Ad-mTERT,纯化后的重组腺病毒载体Ad-mTERT在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测定病毒滴度。结果PCR及酶切证实:mTERTDNA正确克隆到穿梭质粒pAC中,带mTERTDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区,并在293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-mTERT。结论成功构建了小鼠TERT基因重组腺病毒载体,为研究其用于肿瘤的基因治疗奠定基础。

端粒酶及蛋白亚单位在骨巨细胞瘤中的表达

【目的】检测人端粒酶活性和端粒酶蛋白亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因在不同分级骨巨细胞瘤组织中的表达情况。【方法】收集骨巨细胞瘤样本并进行病理学分级,采用 TRAP 方法检测端粒酶活性,RT-PCR方法检测各样本中 hTERT 基因的表达,经薄层分析扫描进行定量分析。【结果】约80%的骨巨细胞瘤组织中有端粒酶活性表达,与表达组织学分级差异无统计学意义(P>0.05)。4例骨巨细胞瘤Ⅰ级样本不表达 hTERT 基因或表达极弱,13例骨巨细胞瘤Ⅱ级与3例骨巨细胞瘤Ⅲ级的样本有较高的 hTERT 基因表达水平,与骨巨细胞瘤Ⅰ级的表达差异有统计学意义(P<0.05),骨巨细胞瘤Ⅱ级与Ⅲ级的 hTERT 表达差异无统计学意义(P>0.05)。术后复发样本 hTERT 基因表达亦较其他样本明显增高。【结论】骨巨细胞瘤组织中可检测到端粒酶活性和 hTERT 基因,hTERT 基因表达量可为骨巨细胞瘤分级及生物学行为的预测提供参考。

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术，构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，采用脂质体法导入ＳＧＣ－７９０１细胞，检测细胞生长曲线、端粒酶活性凋亡、细胞周期、软琼脂中克隆形成率及裸鼠体内成瘤性的变化。结果 成功构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，并导入ＳＧＣ－７９０１胃癌细胞株中，获得稳定表达正、反义基因的细胞系７９０１－Ｓ、７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２。７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２出现显著生长抑制现象，端粒酶活性明显下降，细胞凋亡增加，异型性减小，Ｇ０／Ｇ１期细胞增加，Ｓ和Ｇ２Ｍ期细胞减少，增殖指数减小，软琼脂中无克隆形成，裸鼠体内成瘤消失。结论ｈＴＲＴ反义基因治疗可以明显抑制ＳＧＣ－７９０１细胞的增殖，部分逆转肿瘤细胞的恶性表型，其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的，提示ｈＴＲＴ基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。

端粒酶催化亚单位蛋白及PCNA在尖锐湿疣组织中的表达及意义

目的探讨尖锐湿疣(CA)组织中端粒酶催化亚单位蛋白(hTERT)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及意义。方法用免疫组化SP法分别检测35例CA组织和18例正常上皮组织中hTERT和PCNA的表达。结果hTERT蛋白在CA组织中阳性29例,阳性率为82.86%,在18例正常上皮中,阳性1例,阳性率为5.56%,二者比较差异有显著性(P<0.01);PCNA在35例CA组织中阳性30例,阳性率85.71%,而18例正常上皮中PCNA阳性率55.56%,PCNA两组阳性率之间差异有显著性(P<0.05);hTERT和PCNA之间的阳性表达呈正相关(r=0.681,P<0.01)。结论hTERT在CA发生、发展中起一定作用,hTERT和PCNA表达呈正相关,表明hTERT与细胞的增殖有关。

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR

hTRT反义基因转染对肝癌细胞端粒酶亚单位及细胞周期的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化活性亚单位 (Humantelomerasereversetranscriptase ,hTRT)反义基因转染对HepG2 肝癌细胞株端粒酶亚单位及细胞周期的影响。方法 采用流式细胞仪检测hTRT正义基因转染的HepG2 细胞(HepG2 S)以及hTRT反义基因转染的HepG2 细胞 (HepG2 AS)的细胞周期 ,采用RT PCR法检测上述细胞hTRT、端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白 1(TP1)以及c myc和bcl 2基因的变化 ,同时采用Westernblot检测hTRT蛋白质的变化。结果 HepG2 AS出现G0 G1 期阻滞 ,增殖指数增加 ,凋亡率亦明显增加 ,进一步研究发现 ,HepG2 AS端粒酶亚单位hTRT在蛋白质和mRNA水平均表达减少 ,而TP1、hTR无明显变化 ,bcl 2和c mycmRNA的表达亦明显下调。结论 hTRT反义基因不仅可以下调HepG2 细胞hTRTmRNA和蛋白质的表达 ,而且可以下调c myc、bcl 2mRNA的表达 ,从而一方面降低端粒酶活性 ,另一方面一定程度增加凋亡细胞的比率 。

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Westernblot检测hTERT蛋白及I、III型胶原表达。染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白和I、III型胶原表达增加,体外传代次数增加,传至75代仍保持以2d的倍增周期生长,并且染色体仍为23对,均为正常二倍体细胞;裸鼠皮下不具有成瘤的能力;而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次,出现生长停滞现象。结论外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维细胞增殖旺盛,寿命延长,且不具有恶性表型。

端粒酶与凋亡相关蛋白在卵巢交界性肿瘤中的表达

目的:探讨端粒酶蛋白亚单位(hTERT)与凋亡相关蛋白(bcl-2、caspase-3)在卵巢上皮性交界性肿瘤中的表达及临床意义。方法:选取天津市肿瘤医院病理科存档的卵巢上皮性交界性肿瘤41例,采用免疫组化SP法检测hTERT、bcl-2与caspase-3在肿瘤组织中的表达,与22例良性、30例恶性肿瘤进行比较,并探讨三者间表达的相关性。结果:1)hTERT在卵巢交界性肿瘤中阳性率为46.3%,而良性与恶性肿瘤分别为36.4%,73.3%,与交界性肿瘤相比,恶性肿瘤阳性率明显升高(P=0.023),而良性肿瘤与之的差异无统计学意义(P=0.446)。2)bcl-2和caspase-3在卵巢交界性肿瘤中阳性率为58.5%和73.2%,良性与恶性肿瘤分别为59.1%、72.7%和86.7%、43.3%,其中bcl-2的阳性率在交界性肿瘤中明显低于恶性肿瘤(P=0.010),caspase-3反之(P=0.011);但它们在交界性肿瘤中的表达无相关性(r=-0.063,P>0.05),且二者在交界性与良性肿瘤间的差异无统计学意义(P=0.966,0.970)。3)对93例卵巢肿瘤研究发现,hTERT与bcl-2蛋白表达无相关性(r=0.037,P>0.05);hTERT与caspase-3表达呈显著负相关(χ2=4.8109,r=-0.227,P<0.05)。结论:hTERT蛋白表达可以反映端粒酶活性与hTERTmRNA水平,与凋亡相关蛋白(bcl-2、caspase-3)的联合检测可进一步判断卵巢交界性肿瘤良恶性。

人端粒酶蛋白催化亚单位基因逆转录病毒真核表达质粒的构建及其对人乳腺癌相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建人端粒酶蛋白催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)逆转录病毒真核表达质粒,并检测其在人乳腺癌相关的成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)中的表达及其对CAF增殖的影响。方法扩增pIRES-EGFP-hTERT质粒,酶切回收hTERT片段,正向克隆至逆转录病毒载体pBABE-puro上,构建重组质粒pBABE-puro-hTERT,转染PT67细胞,进行逆转录病毒的包装。将PT67细胞上清感染原代培养的人乳腺癌CAF,荧光定量PCR和Westernblot分别检测hTERT基因在人乳腺癌CAF中的转录和表达,流式细胞术检测细胞的增殖情况。结果重组质粒pBABE-puro-hTERT经酶切和测序证实构建正确;与未处理的人乳腺癌CAF和感染pBABE-puro的细胞相比,感染重组质粒的人乳腺癌CAF中hTERT基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显增强,其增殖指数也明显增加(P<0.05)。结论成功构建了hTERT基因逆转录病毒真核表达质粒,其能增强人乳腺癌CAF的增殖能力,为乳腺癌微环境CAF的研究提供了良好的细胞模型。

人端粒酶蛋白催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞增殖的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEF)增殖的影响。方法体外培养hEF。应用脂质体转染法将pIRES2增强性绿色荧光蛋白(EGFP)hTERT正义重组质粒及pIRES2EGFP空载质粒分别导入hEF中,相应称为hEFhTERT和hEFEGFP。采用蛋白质印迹法(Westernblot)检测正常hEF、hEFhTERT、hEFEGFP中hTERT蛋白、分化抑制因子Id1、增殖细胞核抗原(PCNA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达水平。用噻唑蓝(MTT)法测定3种细胞的生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期并计算增殖指数(PI)。结果(1)Westernblot与hEFEGFP和hEF比较,hEFhTERT中的hTERT蛋白、Id1、PCNA和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平均较高。(2)MTT法细胞接种后第4—6天,hEFhTERT的吸光度(A)值明显高于hEF和hEFEGFP(P<005),接种后1—6dhEF与hEFEGFP的A值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)细胞周期与hEFEGFP和hEF比较,hEFhTERTG0/G1期细胞较少,S、G2/M期细胞较多;其PI为5747%,高于hEFEGFP(13.13%)和hEF(17.38%)。结论外源性hTERT基因转染可使hEF增殖能力增强。

人端粒酶催化亚单位基因转染人胚胎成纤维细胞后胶原的变化

目的 将重组正义hTERT基因荧光真核表达载体导入人胚胎成纤维细胞 (hEF)中 ,探讨外源性hTERT基因转染对hEF细胞胶原含量变化的影响。方法 应用脂质体法将正义重组pIRES2 -EGFP -hTERT质粒及空载pIRES2 -EGFP质粒分别转染至原代培养hEF中 ,westernblot检测转染细胞和未转染细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化 ;放免法检测转染细胞和未转染细胞培养液上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。结果 外源性hTERT基因转染细胞 (hEF -hTERT)较未转染细胞 (hEF)和空载体转染细胞 (hEF -EGFP)中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显增加 ;hEF -hTERT细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量也较hEF和hEF -EGFP细胞有显著增加。结论 外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEF细胞胶原合成增加 。

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTRT)反义基因转染对SGC 790 1胃癌细胞株形态学的影响 ;方法 采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC 790 1胃癌细胞株中 ,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化。结果 与未转染细胞相比 ,光镜下hTRT反义基因转染的SGC 790 1胞体增大 ,胞浆丰富 ,分裂相减少 ,核浆比增大 ,异型性减小 ;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富 ,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊 ;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多 ,胞体周围可见大量颗粒样物质 ,根据AB/PAS染色结果 ,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒。结论 hTRT反义基因有促进SGC 790 1细胞分化的作用。

BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究

目的 将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF 7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF 7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响。方法 应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF 7细胞中,Westernblot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化。MTT比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF 7细胞增殖活性的变化。结果 外源性BRCA1真核表达质粒组MCF 7细胞较未转染组MCF 7细胞hTERT蛋白表达明显减弱。BRCA1基因转染后的MCF 7细胞的增殖活性明显降低。结论 外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF 7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF 7细胞的增殖能力。BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用。

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞表型的影响

目的 探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染人胚胎成纤维细胞 (hEFs)后细胞是否存在恶性表型。方法 应用脂质体法将pIRES2 EGFP hTERT正义重组质粒及pIRES2 EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs ,Westernblot分别检测hTERTmRNA和蛋白质的表达。采用染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验分析转染细胞是否存在恶性表型。结果 原代培养hEFs中存在较弱水平的hTERT基因mRNA及蛋白质表达 ,但外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERTmRNA及蛋白表达显著增加。hTERT转染后细胞染色体仍为 2 3对 ,且均为正常二倍体细胞 ;裸鼠皮下不具有成瘤的能力。

顺铂对肝癌细胞BEL-7404、BEL-7404/ADM中hTERT表达的研究

目的观察不同浓度及作用时间顺铂对BEL-7404、BEL-7404/ADM肝癌细胞hTERT-mRNA表达及影响。方法以不同浓度顺铂处理BEL-7404细胞24h、48h、72h后,RT-PCR检测hTERT-mRNA表达。结果不同浓度DDP处理48h、72h后,BEL-7404细胞hTERT-mRNA表达明显受抑,与对照组比较有显著性差异,对比BEL-7404/ADM细胞,随着DDP剂量和作用时间的增加,hTERT活性也呈减弱趋势。结论顺铂可降低BEL-7404、BEL-7404/ADM细胞hTERT-mRNA表达,表现为明显的时间及浓度的依赖性。

宫颈脱落细胞hTERT mRNA表达在宫颈疾病诊断中的作用

目的探讨宫颈脱落细胞中人端粒酶逆转录酶催化蛋白亚单位信使RNA（h TERT mRNA）的表达在宫颈疾病诊断中的作用。方法应用RT-PCR法检测宫颈鳞状细胞癌（SCC）、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）Ⅱ~Ⅲ、CINⅠ、慢性宫颈炎和正常子宫颈的宫颈脱落细胞中h TERT mRNA表达情况,对各组h TERT mRNA阳性率进行统计分析。结果在各种宫颈疾病病例中,宫颈脱落细胞h TERT mRNA的阳性率依次为SCC（94.9%）〉CINⅡ~Ⅲ（70.1%）〉CINⅠ（46.7%）〉慢性宫颈炎（7.1%）和正常子宫颈（5.0%）（P〈0.01）。慢性宫颈炎与正常子宫颈比较,h TERT mRNA阳性率差异无统计学意义;在SCC和CIN各级病变中,h TERT mRNA阳性率与组织病理学级别的升高存在密切关系。结论宫颈脱落细胞h TERT mRNA可作为宫颈疾病进展的早期预警指标。