正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建

目的构建正义和反义端粒酶 RNA 组分((human telomeraseRNA components,hTR)基因真核表达载体.方法用 Mlu Ⅰ和 Sal Ⅰ从 pGRN83质粒上切下约579 bp 的hTR cDNA 片段,分别定向连入 pcl-neo 的 Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ和Mlu Ⅰ/Xho Ⅰ酶切位点上,即构建成了 hTR 的正反义表达载体,并经酶切鉴定和测序确认.结果经酶切鉴定和测序证明,所构建的正反义 hTR 真核表达载体与设计完全一致.结论成功构建了人端粒酶 RNA 的正反义真核表达载体,为进一步研究正反义 hTR 基因转染对胃癌细胞端粒酶及生物学行为的影响奠定了基础.

RNA干扰hTR基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的影响

目的:探索RNA干扰(RNAi)hTR基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的影响,为膀胱尿路上皮癌基因治疗提供新的途径及依据。方法:构建以hTR基因为靶点的RNA干扰装置PhTR-siRNA,对其进行筛选和鉴定;检测PhTR-siRNA对BIU-87细胞的生物学效应,包括抑制BIU-87细胞的生长情况、端粒酶活性检测、实时定量PCR(RealTime-PCR)验证hTR变化。结果:PhTR-siRNA干扰hTR基因后膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株的生长受到抑制,明显抑制端粒酶活性,实时定量PCR验证hTR基因明显减少。结论:RNA干扰hTR基因能明显抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株的生长,可作为一种膀胱尿路上皮癌的基因治疗方法。

端粒酶RNA及其催化亚单位基因hTRT在睑板腺癌中的表达

目的 探讨端粒酶RNA(hTR)及端粒酶催化亚单位基因hTRT在睑板腺癌中的表达意义。 方法 用原位杂交法检测hTR及hTRT在55例睑板腺癌、12例霰粒肿、4例睑板腺腺瘤中的表达;用EnVision法对Ki-67进行免疫组织化学染色,其结果用计算机图像自动分析系统进行量化,把积分光密度值作为肿瘤增殖指数;用SAS统计软件包对影响睑板腺癌的危险因素(性别、年龄、病程长短、肿瘤大小、肿瘤分化程度等)进行分析,结合增殖指数,hTR、hTRT表达的半定量结果对影响睑板腺癌预后因素进行综合评估。 结果 hTR在睑板腺癌中的阳性表达率为84.45％,hTRT的阳性表达为51.8％,hTR及hTRT在睑板腺癌中的表达明显高于癌旁组织、霰粒肿、睑板腺腺瘤(P<0.01)。hTR与睑板腺癌的分化有关(r=0.455,P<O.01);hTRT与肿瘤增殖指数Ki-67有关(r=0.410,P<0.01)。 结论 睑板腺癌变过程中,端粒酶RNA(hTR)及催化亚单位基因hTRT对端粒酶激活具有上调作用;hTR阳性表达与睑板腺癌的分化状态呈负相关,hTRT与睑板腺癌的增殖有关。

正反义人端粒酶RNA组分(hTR)逆转录病毒真核表达载体的构建

端粒的功能是完成染色体末端的复制,防止染色体免遭融合、重组和降解,其长度的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础,而调控端粒长度的关键分子则是端粒酶.端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用.端粒酶RNA(hTR) 作为端粒酶的组成部分决定着端粒的重复序列并参与端粒酶的活化.本研究将反义端粒酶RNA基因插入到逆转录病毒质粒载体PLXSN中,构建真核表达重组质粒PLXSN-hTR,以期重组质粒表达反义端粒酶RNA,从复制、转录、及翻译三个水平发挥作用,调控肿瘤细胞的端粒长度和端粒酶的活性,抑制或逆转肿瘤细胞的恶性表型,为研究和探索基因治疗肿瘤奠定基础.

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。

RNA干扰人端粒酶hTR基因对HeLa细胞增殖的影响

目的:探讨RNA干扰抑制人端粒酶RNA组分(human telomerase RNA component,hTR)的表达对宫颈癌细胞(HeLa细胞)增殖的影响。方法:hTR基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法稳定转染HeLa细胞。RT-PCR法检测hTR的mRNA表达水平,TRAP-PCR法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖。结果:RT-PCR结果表明,稳定转染RNA干扰表达重组体的细胞株,其hTR基因的mRNA抑制率较无转染对照组下降了(59.7±3.3)%,较转染空载体组下降了(56.3±4.4)%;实验组细胞端粒酶活性下降,生长速度明显减慢。结论:利用RNA干扰技术抑制hTR基因在HeLa细胞的表达能抑制该细胞端粒酶活性和增殖活性。

hTERT双链RNA对肺癌细胞端粒酶的抑制作用

背景与目的:RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是基因功能研究新技术,其机制是通过双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)与靶RNA结合并将其降解。本实验探讨dsRNA对肺癌细胞端粒酶逆转录酶组分(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)抑制的可能性和特异性,了解其对肺癌细胞增殖的影响,观察其是否对真核细胞有非特异杀伤作用,探讨其在肿瘤研究和治疗方面应用的可能性。方法:RT-PCR和PCR扩增hTERT基因两个外显子和一个内含子部分序列,采用正、反义cDNA链串联形式构建dsRNA真核表达载体,转染肺癌A549细胞。RT-PCR检测hTERTmRNA表达,Westernblot检测hTERT蛋白表达,TRAP法检测端粒酶活性,倒置显微镜观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线了解细胞增殖情况。结果:hTERT外显子的两段dsRNA作用肺癌A549细胞后,都表现出hTERT基因表达抑制、端粒酶活性下降、细胞增殖受到抑制,而且,dsRNA未引起细胞非特异死亡。结论:hTERTdsRNA能特异使hTERT基因沉默,对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞生长具有明显的抑制作用,有可能成为肺癌基因治疗的新方法。

益气解毒颗粒对大鼠鼻咽癌变中端粒酶和端粒酶RNA表达的影响

目的 :探讨中药复方益气解毒颗粒防治鼻咽癌的作用机制。方法 :用二亚硝基哌嗪 (DNP)诱导大鼠鼻咽癌动物模型 ,观察益气解毒颗粒对大鼠鼻咽癌变中病理形态改变以及端粒酶和端粒酶RNA表达的影响。定期分批处死大鼠 ,取鼻咽组织作病理学检测 ,用PCR -ELISA和NestedRT -PCR法检测大鼠鼻咽组织端粒酶的活性和端粒酶RNA的表达。结果 :灌服益气解毒颗粒大鼠鼻咽癌发癌率 0 (0 /5 ) ,明显低于盐水对照组 80 % (4/5 ) (包括原位癌和浸润癌 ) ;其端粒酶活性为 0 2 4± 0 11,也明显低于对照组 0 93± 0 2 3(P <0 .0 5 ) ;维甲酸组发病率为 0 (0 /5 ) ,端粒酶活性为 0 2 7± 0 13;各组端粒酶RNA均为阳性。维甲酸组大鼠于 2 15～ 30 8d间逐步死亡。结论 :益气解毒颗粒能阻断DNP诱导大鼠鼻咽癌变 。

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的表达

本文采用反转录套式PCR(nested RT-PCR)和PCR端粒重复扩增(TRAP)方法分别检测了5种人生殖道癌细胞株端粒酶RNA(hTR)基因及端粒酶活性的表达。结果表明,宫颈癌HeLa和SiHa细胞株,绒毛膜癌JAR和BeWo细胞株及卵巢癌OCCI细胞株hTR及端粒酶活性均呈强阳性。但正常卵巢、宫颈和胎盘组织hTR和端粒酶呈阴性或弱阳性。提示反转录套式PCR和端粒重复扩增法可以简便而有效地检测端粒酶RNA及端粒酶活性。端粒酶的激活与肿瘤细胞增殖密切相关,并可能成为一项具有临床价值的肿瘤标志物。

RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响。方法构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况。结果成功制备出hTERTsiRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P<0.05);感染后24h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系。结论hTERTsiRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制。

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响

目的探讨针对人端粒酶RNA(hTR)及其催化亚基(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法将hTR-siRNA、hTERT-siRNA(100nmol/L)单独或联合转染人肾癌786-0细胞,采用RT-PCR法检测hTR、hTERTmRNA表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果(1)hTR-siRNA可显著降低786-0细胞hTRmRNA表达(P<0.01),hTERT-siRNA可显著降低hTERTmRNA表达(P<0.01),但彼此互不影响。(2)二者均能显著抑制端粒酶活性(P<0.01,P<0.01),并增加786-0细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率(P<0.01,P<0.01)。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性(P>0.05)。结论hTR、hTERTsiRNA通过抑制各自基因表达,抑制人肾癌细胞端粒酶活性,进而抑制增殖、促进凋亡。

反义端粒酶RNA对人胃癌细胞端粒长度及端粒酶活性调控的研究

目的 探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人胃癌细胞端粒长度 (TRF)及端粒酶活性的调控作用。方法 应用反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染胃癌细胞SGC790 1,通过分子杂交及端粒重复扩增PCR方法检测hTR表达及端粒、端粒酶活性变化。结果 经HYR筛选 ,转染细胞形成稳定克隆 ,反义hTR表达增强、正义hTR表达下调 ,平均TRF缩短、端粒酶活性受抑。结论 反义hTR对胃癌细胞TRF及端粒酶活性的调控可能是通过其对hTR模板的“封闭”而发挥作用的 ,反义hTR可以作为胃癌基因治疗的一种新靶点。

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

目的探讨polo-like kinase-1(PLK1)基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,si RNA),转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。结果所设计的5个si RNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4si RNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。结论PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 si RNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。

质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性

为了探讨靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(s iRNA)表达载体是否具有抑制H eL a细胞端粒酶活性的能力,人工合成2条64个核苷酸(n t)的片段,其中19n t与hTERT基因1789-1807位碱基同源,将其退火、连接到质粒pSU PER中,构建pSU P-hTE。在pSU P-hTE基础上,把该质粒的启动子和64n t插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP-C 1中生成pEGFP-hTE,从而获得新霉素抗性筛选质粒。将pEGFP-hTE用脂质体转染H eL a细胞,G 418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代,用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、H eL a细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力。结果显示,pEGFP-hTE转染的H eL a细胞与对照组比较,hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38%,但细胞增殖能力没有明显改变。以上结果表明,pEGFP-hTE能通过RNA干扰(RNA i)途径特异性抑制H eL a细胞hTERT基因的表达,从而有效抑制细胞端粒酶活性,这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径。

大肠癌中端粒酶RNA的表达及意义

目的 :探讨端粒酶RNA(hTR)表达在大肠癌发生、发展中的意义以及与细胞增殖的关系。方法 :应用原位杂交方法检测 2 6例大肠癌、18例大肠腺瘤、18例大肠息肉及 5例炎症病变中端粒酶hTR的表达。应用免疫组化EnVision法检测Ki 67抗原的表达 ,反映细胞增殖活性。结果 :2 6例大肠癌hTR以强阳性表达为主 (2 1/2 6 ,80 8% ) ;18例大肠腺瘤hTR大部分呈弱阳性表达 (12 /18,66 7% ) ,少数呈强阳性 (5 /18,2 7 8% ) ;息肉、炎症hTR为弱表达。端粒酶hTR表达在大肠良、恶性病变中存在差异 (P <0 0 1) ,并且随肿瘤分化程度的下降、浸润深度的增加以及淋巴结转移的发生 ,hTR表达增强 (P <0 0 5 )。此外 ,在细胞增殖活跃区域 ,显示出高水平hTR的表达。结论 :在大肠肿瘤发生早期就有端粒酶hTR表达的上调 ,而且hTR表达与肿瘤分化程度、浸润和转移等呈正相关。hTR表达也与细胞增殖活性相关。用原位杂交方法检测端粒酶hTR的表达 。

人端粒酶RNA的cDNA探针制备及其对胃粘膜细胞端粒酶RNA表达的检测

目的 建立人端粒酶RNA表达的检测方法。方法 制备人端粒酶RNA ,(humantelomeraseRNA ,hTR)的cDNA探针 ,分别应用RNA斑点杂交与端粒重复序列扩增法 (TRAP)分析检测不同胃粘膜的端粒酶RNA的表达与端粒酶活性。结果 人端粒酶RNA的cDNA探针制备成功。 18例活检胃癌组织及 4 5例手术胃癌组织RNA斑点杂交检测的阳性率均为 10 0 % ,相应TRAP分析的阳性率分别为 88 89%、 86 6 7% ,低于RNA斑点杂交 (P <0 0 5 )。同时RNA斑点杂交结果提示在非癌胃组织中随着肠化程度增高人端粒酶RNA表达也增强。结论 RNA斑点杂交检测人端粒酶RNA ,具有高度的敏感性和特异性 。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。