应用银染端粒重复序列扩增法检测人肝癌细胞系端粒酶活性的研究

观察人肝癌细胞的端粒酶活性。应用非放射同位素银染的端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ），检测６株人肝癌细胞株（ＢＥＬ－７４０２，ＨｅｐＧ２，ＱＧＹ－７７０１，ＱＧＹ－７７０３，ＳＭＭＣ－７７２１，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）的端粒酶活性，同时检测ＲＮａｓｅ处理的阴性标本。６株人肝癌细胞的端粒酶均为阳性。

应用端粒重复序列扩增法检测原发性肝癌组织端粒酶活性的研究

目的:检测原发性肝癌及癌旁组织端粒酶活性并探讨端粒酶活性在原发性肝癌中的临床意义。方法:应用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测36例原发性肝癌及癌旁组织和3例正常肝组织端粒酶活性。结果:36例原发性肝癌组织有29例(80.6%)阳性。而36例癌旁组织只有4例(11.1%)阳性。3例正常肝组织均阴性。4例癌旁组织端粒酶阳性的患者均于术后半年内复发。结论:原发性肝癌癌旁组织端粒酶活性可望成为预测原发性肝癌术后复发的重要指标,对患者术后治疗方案的选择以及术后随访观察具有一定的指导意义。

检测端粒酶活性的端粒重复序列扩增法的初步建立

端粒是真核线性染色体末端结构,人端粒DNA由(TTAGGG)n重复序列组成.端粒酶是核糖核酸蛋白酶,具有RNA依赖的DNA合成酶活性,可重新合成端粒的重复序列.最近研究证实端粒及端粒酶与细胞衰老及肿瘤相关,是近年来生物学研究的热点.检测端粒酶活性是研究端粒酶的基本方法,同时具有潜在的临床诊断价值.本文拟应用最新的端粒重复序列扩增法(Telomeric Repeat AmplificationProtocal,TRAP),检测肝癌细胞端粒酶活性.

银染端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性及其临床应用

目的 建立银染端粒重复序列扩增法(TRAP)测定肿瘤细胞的端粒酶活性.方法:将银染与TRAP相结合,测定了人肿瘤细胞株及穿刺细胞标本的端粒酶活性.结果:人肿瘤细胞株端粒酶活性为阳性,35例病理诊断为恶性肿瘤的穿刺标本中,33例端粒酶活性阳性,12例良性病变均为阴性.结论:银染TRAP法是特异,敏感及快速的端粒酶活性的检测方法,提示该方法可成为恶性肿瘤的诊断指标之一.

银染端粒重复序列扩增法检测肺癌端粒酶活性

目的 评价端粒酶能否作为肺癌诊断的一个肿瘤标志物。方法 采用改良的银染端粒重复序列扩增法 (TRAP)检测 34例人肺癌手术标本 (包括癌组织、相应癌旁组织与正常组织标本各 34份 ,2 8个相应淋巴结 )的端粒酶活性。另有肺囊肿、肺炎性假瘤各 3例作为对照。结果 88.3% (30 / 34 )的肺癌癌组织端粒酶阳性 ,正常组织全部阴性。结论 端粒酶可以作为肺癌诊断的一个肿瘤标志物 ,改良的银染TRAP法成本低、污染少 。

端粒重复序列扩增-银染色法用于端粒酶活性测定的研究

目的 :建立端粒重复序列扩增 (TRAP) -银染色技术 ,探讨端粒酶活性检测在肿瘤诊断中的意义。 方法 :用裂解液提取组织细胞中的端粒酶模板 ,在特异引物作用下进行 PCR扩增 ,所得产物用氯仿∶异戊醇 (2 4∶ 1)处理浓缩 ,作聚丙稀酰胺凝胶垂直板电泳 ,经硝酸银染色分析端粒酶活性。 结果 :TRAP-银染色法能准确特异地检测小鼠骨髓瘤细胞 (SP2 / 0 )的端粒酶活性 ,灵敏度可达 1× 10 2个细胞。端粒酶阳性率在 2 3例各种恶性肿瘤组织中为 86 .9% (2 0 / 2 3) ,而在 19例炎性包块与良性增生组织为 5 .3% (1/ 19) ,5例正常组织中未发现有端粒酶活性。 结论 :TRAP-银染色法简便快速、具有较好的测定敏感度与重复性 ,对临床恶性肿瘤疾病的诊断具有良好的应用前景。

银染端粒重复序列扩增法检测肝癌模拟肝穿组织端粒酶活性的研究

目的:探讨细针穿刺肝活检组织行端粒酶活性检测用于肝细胞癌(HCC)诊断的可行性。方法:HCC共28例,每例HCC肿瘤切除后立即行肝肿瘤模拟细针穿刺。应用非放射性同位素银染的端粒重复序列扩增法(TRAP),分别对28例模拟肝穿组织和28例肿瘤切取组织行端粒酶活性检测。结果:模拟肝穿组织与肿瘤切取组织的端粒酶检测结果完全一致,阳性率均为82%(23/28)。结论:模拟肝穿组织与肿瘤切取组织在HCC端粒酶活性检测方面具有同等的效果。该结果提示,B超引导下经皮肝穿刺活检行端粒酶活性检测在HCC的诊断、治疗效果评价和预后的判断方面具有一定的应用前景。

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法将端粒重复序列扩增测定法（ＴＲＡＰ）与微孔板杂交 相结合建立了非放射性检测方法，对３例正常肝组织和４例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织 进行检测。结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性，而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性，肝癌凋亡组织端粒酶活性 显著降低。结论 该定量分析方法简单、灵敏、特异性强，可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。

端粒重复序列扩增法检测胃癌组织中端粒酶活性研究

目的 :研究胃癌组织、癌旁及远端正常胃组织中的端粒酶活性 ,探讨其作为胃癌肿瘤标记物的可能性。方法 :采用TRAP-ELISA法检测了 5 1例胃癌组织、癌旁及远端正常胃组织的端粒酶活性表达。结果 :5 1例胃癌组织中端粒酶阳性表达 48例( 94.1%) ,癌旁组织为 17例 ( 3 3 .3 %) ,远端正常胃组织未检测出端粒酶活性。结论 :端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤基因标志 ,有可能成为胃癌早期诊断和治疗的理想标记物。

SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性

目的采用实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQ-TRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果。结果 RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为98.92%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性(r2=0.762 5)。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论 RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

银染端粒重复扩增法的建立及初步应用

目的 建立检测端粒酶活性的银染端粒重复扩增法。方法 以银染替代放射性核素分析结果 ,加入内标防止假阴性结果出现而建立银染端粒重复扩增技术 ,并运用此法检测 36例乳腺癌组织和 2 4例乳腺良性病变组织标本端粒酶活性 ,同时与溴乙锭染色的端粒重复扩增法进行比较。结果 36例乳腺癌组织中 33例阳性 (91.7% ) ,2 4例乳腺良性病变组织无 1例阳性。与溴乙锭染色端粒重复扩增技术相比 ,银染端粒重复扩增技术可见到更多更清晰的带形。结论 实验结果表明本法与放射性同位素显影的端粒重复扩增技术相比是 1种更为简便、安全、可靠的端粒酶活性检测方法。

端粒重复扩增-微孔板杂交法检测妇科肿瘤端粒酶活性的研究

目的 :探讨妇科几种常见恶性肿瘤与端粒酶活性的关系。方法 :采用端粒重复扩增 (TRAP)扩增端粒酶产物 ,通过生物素 -亲和素将扩增产物结合于微孔板 ,并与荧光素 (FITC)标记的特异性探针杂交 ,经酶标抗荧光素抗体结合而显色。结果 :妇科恶性肿瘤端粒酶活性检出 2 5例 (89.3% ) ,而肿瘤边缘组织检出 14例 (5 0 .0 % ) ,正常对照组织检出 10例 (35 .7% )。恶性肿瘤端粒酶活性显著高于肿瘤远端组织和正常对照组织 (P<0 .0 5 )。结论 :端粒酶激活可能在妇科恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。 TRAP-微孔板杂交法是检测端粒酶活性灵敏而特异的一种方法。

STR遗传标记荧光复合扩增系统的法医学应用

目的:建立D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系,并对其进行法医学实用性研究。方法:利用传统复合扩增技术扩增D20S601、D6S474、D6S2418基因座,在不同条件下对复合扩增系统的同一性、灵敏性、可重复性等进行测试,用实际案例进行验证。结果:建立的D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系的扩增条件要求不高,法医实用性研究证明该体系实用性好。结论:建立了D20S601、D6S474、D6S2418遗传标记的荧光标记复合扩增体系。法医学应用性研究证明,该系统分型结果稳定,重复性好,灵敏度高,对陈旧斑痕具有检测能力,能够对常见介质上的斑痕正确分型,与常见的动物及微生物无交叉反应,可成功应用于法医检案。

恶性肿瘤组织的端粒酶活性分析

目的 :检测端粒酶活性在恶性肿瘤和良性肿瘤及正常组织的表达 ,以探讨端粒酶活性对恶性肿瘤检测的意义。方法 :采用端粒重复序列扩增分析法 (telomericrepeatamplificationprotocolassay ,TRAP)检测 87例恶性肿瘤和 4 7例对照组织中端粒酶的活性。结果 :恶性肿瘤端粒酶活性阳性检出 85 .0 6 % (74 / 87) ,明显高于对照组织 ,(P<0 .0 1) ;端粒酶活性与组织类型无明显相关性。结论 :与对照组织相比 ,恶性肿瘤组织中端粒酶活性明显升高 。

病原生物学检验与临床噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆

孕妇B型链球菌感染率及药物敏感性分析，粪肠球菌与屎肠球菌药敏表型和耐药基因的比较，噬菌体生物扩增法、DNA序列分析及单链构象多态性分析检测结核分枝杆菌耐药性，噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌标准化研究，噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌标准化研究，噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性……

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

银染-TRAP法检测胸腹水脱落细胞端粒酶活性的研究

目的:探讨检测胸腹水脱落细胞端粒酶活性对于鉴别良恶性肿瘤的临床意义.方法:用Kim法处理48例胸腹水细胞后,利用改进的银染—TRAP(端粒重复序列扩增)法测其端粒酶活性.结果:24例临床及细胞涂片检查证实恶性胸腹水细胞端粒酶活性全部阳性;12例临床证实恶性而细胞检查未找到癌细胞的胸腹水细胞端粒酶活性阳性7例,阴性5例;12例良性胸腹水细胞端粒酶活性全部阴性.结论:端粒酶的激活与恶性胸腹水的发生发展密切相关,并有可能成为一种鉴别良恶性胸腹水快速、灵敏的临床诊断指标.

端粒酶活性与癌胚抗原诊断恶性腹水114例对比分析

目的:比较端粒酶活性(TA)和癌胚抗原(CEA)指标诊断恶性腹水的价值。方法:良、恶性腹水各57例,应用端粒重复序列扩增-杂交-酶联免疫分析技术检测TA、磁性抗体分离酶联免疫测定技术检测CEA。比较TA与CEA诊断恶性腹水的特异性、敏感性、预测值、准确性等指标的差别。结果:腹水标本检测TA与CEA的阳性结果:恶性腹水组分别为48例(84.2%)与33例(57.9%)、良性腹水组分别为:4例(7.0%)与6例(10.5%),组间各指标阳性结果均具有极显著性差异(P<0.01)。TA与CEA诊断恶性腹水的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为:93%与89.5%,84.2%与57.9%,92.3%与84.6%,91.4%与57.9%,87%与73.7%。结论:TA是良好的诊断恶性腹水指标,其诊断价值高于CEA。

美味侧耳ITS序列直接测序与克隆测序比较分析

用CTAB法提取美味侧耳基因组DNA,利用引物ITS1和ITS4扩增其核糖体DNA的ITS片段,凝胶回收试剂盒纯化目的片段。通过PCR产物双向直接测序和克隆测序分别获得其rDNAITS序列,对两种测序方法所得序列及GenBank中美味侧耳ITS片段的序列进行比较分析。结果显示,三条序列的差异非常小,两种测序方法所得序列仅在两端出现差异,序列内部完全一致。

异育银鲫中科3号MSTN基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增（rapid amplication of cDNA ends，RACE）方法分离克隆了异育银鲫（Allogyoge-netics crucian carp）中科3号肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因全长DNA，得到3394 bp全长的DNA，包含3段外显子和2段内含子，其中2098 bp的全长cDNA在NCBI数据库中进行序列比对后，确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73．5％～98．0％，与鲤鱼MSTN基因相似度最高（98．0％），不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT－PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明，MSTN基因在脑中含量最高，其次是肌、鳃、心、肠，在肝脏中含量最低。