端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达。方法:EcoR I,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1600bp小片段,连接入pcDNA3.1载体。经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照。G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆。①细胞用阿霉素处理6h后Westernblot法检测TRF2表达。②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响。结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P>0.05)。结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础。

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响。方法将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只。对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合。建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃。于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量。结果建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用。

联合干扰人端粒酶逆转录酶和端粒重复序列结合因子2基因的表达对乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用

目的探讨联合干扰人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因和端粒重复序列结合因子2（TRF2）基因在乳腺癌基因治疗中的协同效应。方法构建表达小分子干扰RNA（siRNA）-hTERT和siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-hTERT和rAd-TRF2，单独或联合转染人乳腺癌MCF-7细胞。采用Westernblot法检测MCF-7细胞中hTERT和TRF2蛋白的表达，采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测MCF-7细胞的增殖抑制情况，采用流式细胞仪检测MCF-7细胞的细胞周期变化，采用细胞平板克隆形成实验检测MCF-7细胞的克隆形成能力。结果转染48h后，PBS对照组、空载体对照组、阴性对照组、rAd—hTERT转染组、rAd-TRF2转染组以及rAd—hTERT和rAd-TRF2联合转染组乳腺癌MCF-7细胞中hTERT蛋白的相对表达量分别为1．00、0．94±0．02、0．95±0．04、0．18±0．04、0．95±0．01和0．18±0．04；TRF2蛋白的相对表达量分别为1．00、1．01±0．08、0．96±0．02、0．95±0．08、0．22±0．01和0．26±0．02。单独转染tad—hTERT或tad—TRF2后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率仅为54．6％和48．4％，有8．9％±1．2％和9．2％±2．3％的细胞进入分裂期，66．4％±1．5％和64．6％±1．9％的细胞阻滞于G0＋G1期，细胞的克隆形成能力显著下降；联合转染rAd—hTERT和rAd—TRF2后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率高达82．1％，进入分裂期的MCF-7细胞明显减少（为4．4％±1．2％），大量细胞阻滞于G0＋G1期（为81．4％±1．3％），细胞的克隆形成能力下降更加明显。结论联合干扰hTERT和TRF2基因较单基因干扰可获得更有效的乳腺癌基因治疗效果。

端粒重复序列结合因子2小干扰核糖核酸逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

阿霉素（Adriamycin，ADR）和依托泊苷是临床常用的肿瘤化学治疗药物，主要作用机制为抑制DNA拓扑异构酶，导致DNA双链断裂（double—strand DNA breaks，DSB）。肿瘤细胞发生耐药与多种机制有关，其中对DNA损伤修复的影响是其中重要的一环。端粒重复序列结合因子2（telomeric repeat binding factor2，TRF2）能够通过维持端粒末端的T环结构，防止端粒被DNA损伤修复机制检测为DSB，维持端粒的正常结构和功能。

RHPS4限制端粒重复序列结合因子2蛋白的端粒保护作用

目的 :探讨抗肿瘤药物RHPS4影响端粒重复序列结合因子2(TRF2)对端粒保护作用的机制。方法:在过表达TRF2的A375细胞体系中加入RHPS4,通过蛋白质印迹及免疫荧光结合共聚焦显微镜成像技术检测细胞DNA损伤情况,通过流式细胞技术及细胞增殖实验检测药物对细胞增殖的影响。结果 :在A375细胞中过表达外源性TRF2能抑制DNA损伤的修复,但过表达TRF2不能抑制RHPS4诱导端粒损伤,RHPS4诱导的细胞周期停滞和细胞衰老过表达不依赖于TRF2的表达量。结论:TRF2高水平表达不能拮抗RHPS4的致端粒损伤和细胞周期抑制的作用,肿瘤细胞中高表达TRF2不是应用RHPS4药物的反指征。

人端粒重复序列结合因子1^(33-277)在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的 :建立能高效表达人端粒重复序列结合因子 1第 33- 2 77位 (TRF1 33- 2 77)氨基酸的菌株并制备多抗。方法 :设计一对引物 ,分别带有 Kpn 和 Eco RI位点 ,从已经克隆了 TRF1 c DNA全长的重组质粒 p CR -TOPO-TRF1扩增 TRF1 33- 2 77c DNA片段 ,克隆入 PGEM-T质粒 ,测序和酶切图谱鉴定 ,Eco RI酶切后亚克隆入 p GEX-3X的 Eco RI位点之间 ,筛选正向插入重组子。转化大肠杆菌 DH5 a,筛选高表达菌株。结果 :得到高效表达融合蛋白的菌株 DH5 a-TRF1 33- 2 77。其融合蛋白经western blot证实具 TRF1抗原性。结论 :所建立的菌株为 h TRF1单克隆和多克隆抗体制备提供蛋白来源。

小鼠大脑皮层端粒重复序列结合因子2的表达及神经元保护作用

目的 观察小鼠大脑皮层端粒重复序列结合因子2（telomeric repeat binding factor 2,TRF2）表达的增龄性改变,探讨TRF2基因转染对体外培养皮层神经元的保护作用及TRF2在神经元衰老中的作用. 方法 将C57BL/6J小鼠分为青年组（2月龄）和老年组（20月龄）,分别采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）和实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测小鼠大脑皮层TRF2表达;pcDNA-TRF2质粒转染孕18 d胎鼠皮层神经元细胞,喜树碱作用16h,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测神经元细胞存活率. 结果 与2个月龄组小鼠比较,20个月龄组小鼠大脑皮层TRF2表达明显降低;喜树碱作用16h后,转染pcDNA-TRF2的神经元存活率为（75.4±2.6）％,明显高于与转染空载体质粒组（32.6±9.3）％（t=22.85,P＜0.05）. 结论 TFR2表达降低参与神经元衰老,TRF2过表达可能是治疗神经退行性变的新靶点.

端粒重复序列结合因子1和2在口腔黏膜癌组织中的表达及临床意义

目的研究端粒重复序列结合因子(telomere repeat binding factor,TRF) 1、TRF2在口腔黏膜癌组织中的表达情况及临床意义。方法收集2012年7月—2016年7月武汉大学人民医院收治的48例口腔黏膜癌患者癌组织和癌旁组织标本以及32例正常人口腔软组织表本,采用免疫组化方法来检测癌组织、癌旁组织和正常人口腔软组织标本中TRF1与TRF2蛋白的表达情况。结果口腔黏膜癌组织中TRF1的阳性率明显低于癌旁组织和正常组织(P<0. 01),并且高分化与中分化癌组织中TRF1的阳性率显著高于低分化癌组织(P<0. 05)。癌组织中TRF2阳性率显著高于癌旁组织与正常组织(P<0. 01),在高分化与中分化癌组织中TRF2阳性率明显低于低分化癌组织(P<0. 05)。结论 TRF1的阳性率在癌组织中明显降低,而TRF2的阳性率在癌组织中显著升高,表明TRF1与TRF2蛋白表达水平的变化可能与口腔黏膜癌的发生发展密切相关。

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的 :研究 TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平。方法 :定量分析肾组织中 TRF1蛋白的表达水平 ,应用经倍比稀释的 TRF13 3 -2 77纯化蛋白作为定量标准 ,建立了以抗 TRF13 3 -2 77单抗作定量 Wes-tern- blot的方法 ,并以该方法检测 TRF1蛋白在组织中的表达水平。结果 :32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质 ,均值为 2 .4 2 8± 1.35 2 μg/ μl,癌旁自身对照组织 TRF1的表达水平为 3.6 11± 1.92 2 μg/ μl(t=5 .776 ,P<0 .0 0 1)。肿瘤组织内 TRF13 3 -2 77表达水平较相应癌旁组织显著降低 ,并与肿瘤的恶性程度相关 ,差异具有显著性意义 (P<0 .0 1)。结论 :TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低 ,并与肿瘤恶性程度呈负相关。

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的 :研究人端粒重复序列结合因子 (TRF1)在 30例急性白血病细胞中的表达 ,了解 TRF1表达与急性白血病分型的关系 ,以及与端粒酶活性的关系。方法 :用荧光定量 RT- PCR定量检测 30例急性白血病细胞中TRF1m RNA表达情况 ,同时检测 h TERT m RNA的表达 ,并分析两者之间的相关性。结果 :TRF1在急性非淋巴细胞性白血病 (ANLL)细胞中的表达 0 .0 12 6 (0 .0 12 7～ 0 .0 5 46 )明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达 0 .0 4 5 7(0 .0 0 839～ 0 .2 6 2 ) (P<0 .0 0 1) ,但在急性淋巴细胞性白血病 (ALL)细胞中的表达 0 .0 74 5 (1.92× 10 -6～ 0 .193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性 ,且在 ANL L细胞中的表达明显低于 ALL细胞中的表达 (P=0 .0 0 1)。TRF1和 h TERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性 (r=- 0 .173,P=0 .2 0 7)。结论 :TRF1m RNA在 ANLL细胞中表达明显降低 ,而在 ALL细胞中表达无显著改变 ,提示 ANLL细胞中 TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用。

人端粒重复序列结合因子(hTRF1)蛋白质在急性白血病中的表达水平与端粒酶活性关系的研究

为了研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)蛋白质在急性白血病(AL)及正常骨髓组织中的表达水平,AL和正常骨髓组织中端粒酶活性及TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系,定量分析了AL患者及正常人骨髓组织中TRF1蛋白质的表达水平,并应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质作为定量标准,建立以抗TRF133-277单克隆抗体的定量Westernblot的方法,而且以该方法检测TRF1蛋白质在组织中的表达水平;另外,应用TRAP-PCR-ELISA法检测AL患者及正常人骨髓组织端粒酶活性,以研究TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系。结果表明:20例AL患者骨髓组织中TRF1表达水平较正常人骨髓组织显著降低,差异具有显著性(P<0.01);急性淋巴细胞性白血病患者的TRF1表达水平较急性非淋巴细胞性白血病患者略减低,但差异无统计学意义(P>0.05);化疗缓解的患者TRF1表达水平较前增高,但仍低于正常(P<0.01);化疗后完全缓解患者的TRF1表达水平较未缓解的患者显著增高,差异具有显著性(P<0.01);AL患者初发未治时骨髓细胞端粒酶的活性明显高于正常人(P<0.05)和首次缓解者(P<0.01);初发未治时,ALL患者骨髓细胞端粒酶活性略高于ANLL患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性呈明显负相关(P<0.001)。结论:TRF1蛋白质在AL患者骨髓细胞中的表达明显减低,且与疗效及端粒酶活性相关。

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段 (TRF133 -277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF133 -277,将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白兔 ,制备血清过柱纯化 ,将TRF133 -277 和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱 ,血清过GST柱以去除抗GST抗体 ,然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体 ,获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗 ,在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带 ,与阳性对照基本一致。 结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效 ,所获抗TRF133 -277

人端粒重复序列结合因子基因组和假基因研究

目的 :确定人端粒重复序列结合因子 (TERF1)的基因组结构和假基因的定位与结构。方法 :利用 Gen Bank等生物信息学资源 ,NCBI提供的 BLAST及其他相关的生物信息学工具 (Sequencher,DNA Strider和 Autoassembler等 ) ,确定 TERF1基因组和假基因的定位与结构 ,并用 PCR和测序证实。结果 :定位在 8q13上的 TERF1基因组由 10个外显子构成。它有 4个假基因分别分布在第 13、18、2 1和 X染色体上 (Ψ TERF1- 13、Ψ TERF1- 18、Ψ TERF 1- 2 1和Ψ TERF1- X) ,其结构均与 TERF1m RNA相似 ,但缺少部分外显子。Ψ TERF1- 13、Ψ TERF 1- 18和Ψ TERF1- 2 1的周边序列之间存在长度至少 6 0 kb的同源片段。结论 :TERF1基因组含 10个外显子 ,它有 4个加工过的假基因分布在第13、18、2 1和 X染色体上。大片段同源序列属近期重复片段中的染色体间倍增。

端粒重复因子2-P53信号通路在糖尿病心肌病中的作用

目的探讨端粒重复因子2-P53(TRF2-P53)信号通路在糖尿病心肌病(DCM)中的作用。方法体内研究予以链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制造1型糖尿病小鼠模型,9周后超声检测明确DCM模型构建成功。小鼠心脏样本采用免疫印迹(WB)检测TRF2表达水平,采用免疫荧光检测P53表达水平。体外研究予以高糖刺激乳鼠心肌细胞,并采用WB检测TRF2表达水平,采用免疫荧光检测P53表达水平。TRF2 siRNA降低乳鼠心肌细胞TRF2的表达后,采用TUNEL检测凋亡情况,采用衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测衰老情况,采用WB检测P53表达水平。结果体内研究发现,与WT小鼠相比,DCM小鼠TRF2表达下降,P53表达增加。体外研究发现,高糖刺激引起乳鼠心肌细胞TRF2表达下降,P53表达增加。TRF2 siRNA转染降低乳鼠心肌细胞TRF2水平后可促进凋亡和衰老,增加P53表达。结论TRF2-P53信号通路在DCM中起了重要的调控作用。

端粒重复序列结合因子1在子宫内膜癌的表达及与临床病理特征的相关性研究

目的探讨端粒重复序列结合因子1(TRF1)在子宫内膜癌的表达及与临床病理特征的相关性。方法选择行手术诊治的子宫内膜癌患者120例的癌组织标本与癌旁组织标本作为研究对象,所有标本都给予TRF1的免疫组化分析,同时记录患者的临床病理特征并进行相关性分析。结果子宫内膜癌组织中TRF1表达阳性率分别为90.8%,癌旁组织为28.3%,对比有统计学意义(P <0.05)。在子宫内膜癌组织中,TRF1的表达阳性率随着分化程度的降低、临床分期的增加、肌层浸润深度的加深、淋巴结的转移而显著增高(P <0.05); TRF1表达阳性率与患者年龄、大体类型、组织类型无关(P> 0.05)。Spearman等级相关分析显示:TRF1表达与临床分期、肌层浸润、淋巴结转移呈显著正相关性(P<0.05),与分化程度呈显著负相关性(P <0.05)。结论 TRF1在子宫内膜癌组织中呈现高表达状况,与临床病理特征有很好的相关性,可用于指导进行临床诊断与治疗。

端粒酶逆转录酶和端粒重复结合因子2在大鼠心肌细胞发育过程中的表达

目的:观察大鼠心肌细胞发育过程中端粒酶逆转录酶(TERT)和端粒重复结合因子2(TRF2)的表达,探讨TERT活性与心肌细胞分化和发育的关系。方法:应用免疫组化方法分别检测胎鼠孕16d、出生后2、5、10、20d的大鼠心脏标本,观察TERT和TRF2的表达和分布。结果:TERT分布于胎鼠心肌细胞的胞质和细胞核中,出生后2～20d,TERT在胞质的表达呈下降趋势。TRF2主要分布在胎鼠心肌细胞的胞核中,出生后5～20d,TRF2表达阳性的心肌细胞数目逐渐减少。结论:在大鼠心肌细胞发育过程中,TERT和TRF2的表达下调促使部分细胞永久地退出细胞周期而进入终末分化;TERT活性受到了心肌细胞发育过程的调节。

端粒重复序列结合因子1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的探讨人端粒重复序列结合因子1（TRF1）在非小细胞肺癌（NSCLC）肺组织中的表达及其与临床、病理的关系。方法采用Envision免疫组织化学染色法检测40例NSCLC患者手术切除后石蜡包埋标本和37例癌旁正常肺组织中TRF1的表达水平，并分析其与NSCLC患者临床、病理指标及生存期的关系。结果NSCLC组织中TRF1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织（P〈0.01）；TRF1蛋白在NSCLC组织中的阳性表达水平与患者性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度、组织学类型和总生存期等方面的差异均无统计学意义（均P〉0.05）。结论TRF1在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，但其表达水平则与NSCLC的组织学类型、性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度及预后无关。

端粒重复序列结合因子1蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

目的研究端粒重复序列结合因子1(TRF1)蛋白在胃癌中的表达及其与胃癌发生发展的关系。方法用Westernblot方法检测TRF1蛋白在10例正常胃黏膜、15例胃癌前病变、20例胃癌、5例淋巴结转移胃癌组织中的表达。结果TRF1蛋白在癌前病变组、胃癌组、转移癌组比正常组表达高;胃癌组、转移癌组比癌前病变组表达高(P<0.01)。在胃癌组织中,TRF1蛋白的表达与胃癌分化程度有关,分化越差,表达越高(P<0.01)。结论TRF1蛋白可能在胃癌的发生发展中起重要作用。

人端粒重复序列结合因子研究进展

端粒酶作为肿瘤标记物和治疗靶子日益受到重视,端粒重复序列结合因子(TRF)正成为研究端粒酶活性的调节机制的热点。本文就TRF1和TRF2的结构和功能作一综述。