端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响

背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用。本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用。方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照组(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT)。分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISA-PCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响。结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止。asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止。ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶,其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P<0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P<0.001)。结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点。

端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌细胞A549端粒的影响

目的探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译及对端粒缩短和细胞周期的作用。方法将A549细胞随机分组为空白对照、sTANKS、shTERT、asTANKS、ashTERT和asTANKS+ashTERT组,经不同处理,检测hTERTmRNA、端粒酶及端锚酶活性、端粒平均长度及A549细胞寿命。结果ashTERT能抑制hTERTmRNA表达及蛋白质活性;asTANKS不影响hTERTmRNA表达,却能抑制端锚酶活性。asTANKS或ashTERT均可致A549端粒长度缩短,asTANKS+ashTERT则缩短更为明显,其减少A549细胞平均传代数的作用也明显大于asTANKS或ashTERT。结论asTANKS对A549端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,不仅能通过影响端锚酶活性缩短肿瘤细胞A549端粒的平均长度,而且可与端粒酶抑制剂协同作用明显缩短肿瘤细胞的生存周期,这可能成为抗癌作用的新靶点。

端锚聚合酶(tankyrase)研究进展

端锚聚合酶 (tankyrase)是一种位于端粒的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 ,它在端粒酶阳性细胞中过表达可使端粒长度增加 ,从而影响染色体的稳定性 ,与细胞的衰老、死亡和癌变密切相关 ;同时它在细胞中的复杂分布模式和不同类型的存在 。

肺泡样肺腺癌中端锚聚合酶的表达及其与WNT信号通路的关系

目的探讨肺泡样肺腺癌中端锚聚合酶(TNKS)的表达情况及其与WNT信号通路的关系。方法收集72例单一亚型肺泡样肺腺癌组织(肺腺癌组)和67例癌旁正常肺组织(癌旁组)标本,应用免疫组化法检测2组TNKS、β-连环蛋白(β-catenin)和c-myc蛋白的表达情况,并分析3种蛋白在肺腺癌组织中表达的相关性。Westernblot检测TNKS在肺腺癌组和癌旁组中表达的差异性。结果 TNKS蛋白主要于细胞质表达;β-catenin蛋白在肺腺癌组主要于细胞质和细胞核表达,β-catenin在癌旁组主要于细胞质表达,少量于细胞核表达;c-myc蛋白主要于细胞核表达。TNKS、β-catenin和c-myc蛋白在肺腺癌组中的阳性表达率均高于癌旁组(P<0.05)。β-catenin蛋白细胞质和细胞核中的表达与TNKS及c-myc的表达水平均呈正相关(均P<0.05)。Western blot检测示TNKS在肺腺癌组中的相对表达水平高于癌旁组(0.497±0.021 vs.0.237±0.015,t=13.00,P<0.01)。结论 TNKS在肺腺癌中异常高表达,可能是通过调控WNT信号通路,从而促进肺腺癌的发生,抑制TNKS表达或可成为治疗肺腺癌的新靶点。

RNA干扰介导的端锚聚合酶1表达下调诱导人神经母细胞瘤细胞的凋亡

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对人神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础。方法根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列。慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出最佳干扰序列进行后续实验。然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变。并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,最后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制。结果慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L。Real-time PCR检测结果显示,#3 shRNA为最佳的有效靶点。克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降。Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达。此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低。透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态。结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用。

端锚聚合酶在大鼠肝癌发生中的动态变化

目的探讨端锚聚合酶(tankyrase)和端粒酶在肝细胞肝癌发生、发展过程中的动态变化。方法二乙基亚硝胺诱导大鼠肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生,采用Western blot法检测端锚聚合酶的表达,TRAP方法检测端粒酶活性。结果在肝细胞癌变过程中,相对于端粒酶在正常组织和癌前病变中的低水平表达,端锚聚合酶在肝炎期表达就显著增加。但至肝硬化,特别是肝癌期两种检测指标的表达均至高峰,并呈正相关关系(P=0.069,r=0.849)。结论端锚聚合酶可调控端粒酶活性,二者与肝细胞肝癌的发生、发展密切相关。

端锚聚合酶抑制剂XAV939抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖及作用机制研究

目的:研究端锚聚合酶抑制剂XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖的抑制及其作用机制。方法:以人骨肉瘤SOSP-9607细胞为研究对象,采用CCK-8法测定0.5、1、5、10μmol/L XAV939分别作用24、48、72 h后的细胞增殖情况,并计算细胞抑制率;采用流式细胞术检测5μmol/L XAV939作用72 h后的细胞凋亡情况及周期分布;以甘油醛-3-硫酸脱氢酶(GAPDH)为内参,采用蛋白质印迹法测定0.5、1、5、10μmol/L XAV939作用72 h后细胞中β-联蛋白(β-catenin)、G1/S期特异性周期蛋白D1(Cyclin D1)和基质金属蛋白酶7(MMP-7)的相对表达量。结果:1μmol/L XAV939作用72 h后,5、10μmol/L XAV939作用24、48、72 h后,SOSP-9607细胞的抑制率均显著升高(P<0.05或P<0.01)。5μmol/L XAV939作用72 h后,SOSP-9607细胞的凋亡率从3.71%上升至21.03%(P<0.05);G1期细胞的比例由45.5%增至54.8%,S期细胞的比例由27.4%降至24.0%,G2/M期细胞的比例由22.2%降至16.2%(P<0.05)。5、10μmol/L XAV939作用72 h后,SOSP-9607细胞中β-catenin、Cyclin D1和MMP-7的相对表达量均显著下降(P<0.05或P<0.01)。结论:端锚聚合酶抑制剂XAV939能够抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞的增殖,其机制可能与其将细胞周期阻滞于G1期、阻断细胞外因子(Wnt)/β-catenin信号通路有关。

端锚聚合酶抑制剂的作用方式以及药效团模型的构建

为了深入了解端锚聚合酶抑制剂的作用模式,选取15个活性端锚聚合酶抑制剂组成训练集,构建基于配体共同特征的药效团,选取11个活性抑制剂和6个非活性抑制剂组成测试集验证药效团.利用分子对接方法,将15种活性抑制剂对接于端锚聚合酶的腺苷活性口袋中,探究活性抑制剂与端锚聚合酶结合口袋处的关键作用方式.将分子对接结果与药效团模型相结合,构建更精确的药效团模型.基于配体共同特征的药效团模型有5个化学特征,即包含1个芳香环(R)、2个疏水基团(H)和2个氢受体(A).分子对接结果显示,活性抑制剂在腺苷结合口袋处与关键氨基酸的Tyr 1213、Asp 1198和Gly 1196形成氢键.将分子对接结果与药效团模型结合,构建出一个精确的药效团模型(RRHHAAD),在该药效团中,3个氢键分布在腺苷口袋的A和C位点处,2个共轭环(R1和R2)分别与端锚聚合酶的Phe 1188和His 1201形成共轭作用,药效团模型中心的疏水特征(H2)位于B位点处.叠加后得到的药效团可以准确反映腺苷位点的特征,也可以解释抑制剂与端锚聚合酶的互作方式.

端粒端粒酶及端锚聚合酶

端粒、端粒酶以及端锚聚合酶与人类“细胞老化”及“细胞永生化”有着极为重要而特殊的相关性， 这种相关性为老年病和肿瘤的研究带来了新的机遇。因此，近年来越来越受到人们的重视。现就三者的结构、功能及相关性综述如下。

人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

背景:端粒相关蛋白直接影响端粒的功能,调节端粒DNA的长度,与细胞的衰老和癌变密切相关。目的:通过观察正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的变化来找寻细胞正常衰老过程中的关键调控分子。方法:在构建好的细胞复制性衰老模型基础上,利用RT-PCR与westernblot方法在分子与蛋白水平检测端粒相关因子的表达变化,主要检测人胚肺成纤维细胞在复制性衰老过程中端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA、端粒末端保护蛋白1以及P53的表达情况。结果与结论:结果显示,随着细胞的衰老,人端粒结合蛋白1的转录水平未发生改变,而人端粒结合蛋白1的蛋白表达水平有逐渐升高而后快速降低的过程;端锚聚合酶1的mRNA水平及蛋白表达水平未发生变化;端粒末端保护蛋白1随着人胚肺成纤维细胞的衰老表达水平逐渐降低;端粒酶RNA组分随着细胞的衰老呈递增趋势;P53的蛋白表达未发生变化。综上认为,人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1及端粒酶RNA在细胞的复制性衰老过程中起重要作用。

端粒结构及其相关蛋白对端粒长度调控的研究进展

哺乳类动物染色体末端由一段特殊的TTAGGG重复序列及其相关蛋白组成 ,并形成T环和D环结构 ,称作端粒。端粒 3′伸出端由于富含碱基G ,可形成稳定的G 四联体结构。端粒自身的这些结构及其相关蛋白TRF1、TRF2、TIN2、端锚聚合酶等对端粒长度起着重要的调控作用。

一种高效T载体的构建及其对人端锚聚合酶HPS结构域的克隆

目的 :制备一种高效T载体 ,并检测其克隆PCR产物的效率。方法 :构建质粒pGH T ,它包含 2个XcmⅠ酶切位点 ,并在两位点间插入一段约 6 0 0bp的DNA序列。用XcmⅠ彻底消化质粒pGH T后 ,回收线性化大片段 ,即得T载体。利用此T载体克隆人端锚聚合酶 (tankyrase)HPS结构域的PCR产物 ,并用限制酶切鉴定克隆的结果。结果 :自制T载体可高效克隆PCR产物 ,其效率可达 80 %～ 10 0 %。结论 :自制T载体对PCR产物的克隆效率与商品完全相同 ,但使用方便且价格低廉。

端锚聚合酶1在肿瘤治疗中研究进展

端锚聚合酶1(TNKS 1)可通过对端粒结合蛋白1的糖基化修饰调节,使端粒维持在一定长度,导致肿瘤的发生。在许多恶性肿瘤中,TNKS1蛋白呈高水平表达。端锚聚合酶抑制剂具有抗肿瘤活性,小分子端锚聚合酶抑制剂可通过稳定轴蛋白表达,诱导β-连环蛋白降解,对抗Wnt信号转导途径,从而抑制肿瘤生长。Wnt信号系统中的许多生物学进程和致病过程都受TNKS1和TNKS1抑制剂的调控。此外,联合应用TNKS 1抑制剂与其他抑制剂,可使肿瘤细胞发生坏死和凋亡的时间明显缩短。TNKS 1及其小分子抑制剂在维持端粒动态平衡和Wnt/β-catenin信号转导中的作用机制日益明确,成为肿瘤靶向治疗的潜在研究药物。重点讨论TNKS 1的生物学特性,新型TNKS1的特异性抑制剂及其在肿瘤临床治疗中的应用现状。

利用端粒和端粒酶PCR芯片筛选易发/抗肺纤维化小鼠肺组织差异基因研究

目的通过建立易发/抗放射性肺纤维化(RIPF)小鼠模型,利用端粒和端粒酶实时荧光定量PCR(RT-qPCR)芯片筛选易发/抗RIPF小鼠照射前后肺组织差异基因并初步验证。方法采用20 Gy^(60)Coγ射线照射C57BL/6J和C3H/HeN小鼠胸部;通过HE、天狼星红染色,羟脯氨酸、转化生长因子β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)含量检测等,比较这两种小鼠RIPF进程的差异;采用端粒和端粒酶RT-qPCR芯片,分别比较照射前、照射后3个月两种小鼠肺组织端粒和端粒酶相关基因的表达差异,并采用RT-qPCR对差异基因进行初步验证。结果照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织纤维化性病变较C3H/HeN小鼠更为明显;C57BL/6J小鼠肺组织中羟脯氨酸含量显著高于照射前和C3H/HeN小鼠(P<0.05),且其肺泡壁Ⅰ型胶原沉积显著多于C3H/HeN小鼠;C57BL/6J小鼠肺组织促纤维化细胞因子TGF-β和CTGF含量明显高于C3H/HeN小鼠(P<0.05)。端粒和端粒酶RT-qPCR芯片筛选发现,两种对照组小鼠肺组织差异基因48个;照射后3个月两种小鼠肺组织差异基因32个;照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织与照射前相比有8个差异基因,C3H/HeN小鼠肺组织与照射前相比有4个差异基因。对差异基因端锚聚合酶2(Tnks2)基因进行验证,照射前及照射后3个月C3H/HeN小鼠肺组织中Tnks2的表达均高于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。结论^(60)Coγ射线照射前后易发/抗肺纤维化小鼠肺组织存在多个端粒及端粒酶相关差异基因。

消岩汤介导TNKS抑制肺腺癌细胞生长的初步探讨

[目的]探讨端锚聚合酶(TNKS)在消岩汤抗肺腺癌细胞作用中的表达及意义。[方法]采用免疫组织化学检测37例肺腺癌患者癌及癌旁组织中TNKS的表达情况。实时荧光定量聚合酶联反应(qRT-PCR)检测梯度浓度消岩汤处理肺腺癌A549细胞后,TNKS mRNA水平的表达;CCK-8法、γ-H2AX细胞免疫荧光、DNA修复试验分别检测各组A549细胞的增殖、DNA损伤及DNA修复能力,划痕实验及Transwell小室分别检测各组A549细胞的迁移及侵袭能力。[结果]1)TNKS蛋白在肺腺癌组织中的阳性表达率为63.00%,在癌旁组织中阳性表达率为18.92%,差异有统计学意义(P<0.05)。2)随消岩汤浓度升高,A549细胞中TNKS mRNA水平的表达降低。3)当TNKS被下调时,A549细胞增殖活性降低,γ-H2AX表达增强,细胞DNA修复能力、迁移和侵袭能力受抑制,同样给予消岩汤处理细胞后,结果与TNKS下调组一致。[结论]TNKS与肺腺癌细胞的增殖、DNA损伤修复、迁移和侵袭密切相关,消岩汤抗肿瘤作用可能与下调TNKS的表达有关。

顺铂与XAV939联合应用对人肺癌细胞A549增殖、迁移能力的影响及机制

目的观察顺铂联合端锚聚合酶抑制剂XAV939对人肺癌细胞增殖和迁移能力的影响,并探讨其机制。方法将体外培养的人肺癌A549细胞分为空白对照组、顺铂组、XAV939组、顺铂+XAV939组,分别用1μmol/L Na Cl、0.002 g/L顺铂、1μmol/L XAV939、0.002 g/L顺铂+1μmol/L XAV939培养。用MTT法观察各组细胞增殖情况并计算细胞增殖抑制率;用细胞划痕实验和Transwell小室实验观察各组细胞迁移能力;用Western blotting法检测各组细胞中的WNT通路转录因子端锚聚合酶、β-连接素蛋白。结果与对照组相比,顺铂组、XAV939组、顺铂+XAV939组细胞增殖抑制率高(P均<0.05),细胞迁移距离短(P均<0.05),穿膜细胞数少(P均<0.05),细胞中端锚聚合酶、β-连接素蛋白相对表达量低(P均<0.05);与顺铂组和XAV939组相比,顺铂+XAV939组细胞增殖抑制率高(P均<0.05),细胞迁移距离短(P均<0.05),穿膜细胞数少(P均<0.05),细胞中端锚聚合酶、β-连接素蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论顺铂联合XAV939可以抑制人肺癌A549的增殖和迁移,且效果强于单用XAV939或顺铂。这可能与二者抑制WNT通路转录因子端锚聚合酶、β-连接素蛋白表达有关。

Tankyrase1反义核酸干预肺癌移植瘤生长的实验研究

目的:观察Tankvrasel(端锚聚合酶1,TANK1)的正义(TANK1-SODN)及反义寡核苷酸(TANK1-ASODN)作用下人肺癌细胞移植瘤的生长情况,探讨TANK1-ASODN抑制癌细胞增殖的实际效果及作用机制,为肺癌基因治疗提供新线索。方法:将14只荷瘤裸鼠随机分成3组,每日一次瘤体多位点分别注射相应剂量TANK1-SODN、TANK1-ASODN及生理盐水。15天后,观察各组移植瘤体积、组织学及电镜下肺癌细胞超微结构的改变,使用链酶亲和素-酶复合物(SABC)免疫组化法及原位杂交法检测3组移植瘤中端粒酶反转录酶(hTERT)蛋白及其mRNA表达水平。结果:TANK1-ASODN组移植瘤体积明显小于TANK1-SODN及对照组,差异有显著性统计学意义(P<0.01),而TANK1-SODN与对照组肿瘤体积差异无显著性统计学意义(P>0.01)。电镜证实TANK1-ASODN通过多种途径,有明显的癌细胞杀灭效果。此外,TANK1-ASODN组癌细胞hTERT蛋白及其mRNA表达水平明显低于其他两组,差异有显著性统计学意义(P均<0.01)。结论:TANK1-ASODN明显降低了肺癌细胞中hTERT蛋白及其mRNA的高水平表达,促进癌细胞坏死及凋亡,显著抑制了肺癌细胞增殖。

Tankyrase:肿瘤治疗的新靶点

由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1蛋白组成的shelterin端粒蛋白网络参与维持端粒的正常功能。其中Tankyrase可核糖基化TRF1,使其与端粒解离,并导致端粒酶与端粒的结合,从而维持端粒长度的相对恒定。多数肿瘤细胞中端粒酶活性升高,因而端粒酶抑制剂可特异诱导端粒的缩短而抑制肿瘤细胞生长。但端粒缩短是一渐进过程,在端粒酶活性受到抑制直至缩短的端粒丧失其染色体末端保护功能时会有一段时间间隔。因此,端粒的缩短也会降低端粒酶抑制剂的药效。Tankyrase与端粒酶活性升高呈正相关,因而Tankyrase抑制剂可诱导端粒的缩短,进而诱导肿瘤细胞凋亡。在少数以ALT机制维持端粒长度相对恒定的肿瘤细胞中,Tankyrase抑制剂则通过抑制细胞的有丝分裂诱导肿瘤细胞的生长阻滞。此外,Tankyrase抑制剂增强Wnt信号途径中轴蛋白的表达水平,诱导β-连环蛋白的降解,从而抑制肿瘤细胞增殖。由于Tankyrase抑制剂可通过多种途径拮抗肿瘤细胞的生长,因而其表现出光谱的抗肿瘤活性。本文就Tankyrase在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。