基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术和网络药理学探究竹叶青酒缓解急性肝损伤作用机理

该研究首先采用中药系统药理学数据库(TCMSP)结合超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术对竹叶青酒中潜在的功效成分进行筛选与检测,然后采用网络药理学预测成分及疾病靶点,并通过DAVID数据库对共有靶点进行基因本体(GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,进而构建“功效成分-潜在靶点-作用通路”网络以筛选关键功效成分与作用通路。最后,通过分子对接技术,对核心潜在靶点和关键功效成分进行分子对接以验证网络分析预测结果。结果表明,从竹叶青酒中共获得113个潜在活性成分。竹叶青酒可能以柚皮素、京尼平、金合欢素、山奈酚、川陈皮素、苜蓿素为关键功效成分,作用于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)、Toll样受体(TLRs)等信号通路上的RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、JUN原癌基因(JUN)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)等靶点,发挥缓解急性肝损伤的作用。

基于超高效液相色谱-高分辨质谱法高分辨非靶代谢组学的竹叶青组方发酵前后成分比较研究

为探究肠道益生菌发酵对竹叶青药食同源组方的影响,该研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱法对竹叶青组方发酵前后的化学成分进行整体分析。通过高分辨非靶代谢组学技术检测竹叶青组方发酵液发酵前后的化学成分,并进行主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析和差异组分筛选等分析,探讨发酵前后化学成分的变化情况。同时,基于网络药理学方法,探究发酵后显著增加的化学成分的潜在靶标和作用机制。研究结果结合数据库中化合物的精确分子质量、保留时间、分子式、质荷比以及多级质谱裂解信息,从竹叶青组方发酵液筛选鉴定化学成分共46个。高分辨非靶代谢组学对发酵前后样品的鉴定结果显示,正负离子模式下共筛选到91个差异组分,主要以黄酮类成分为主。此外,竹叶青组方经乳酸发酵后新产生70个化学成分(P<0.05)。网络药理学分析结果显示,竹叶青组方发酵后主要成分的作用靶标显著富集在与血管、神经受体、炎症等相关的信号通路上。

汾酒基酒浸泡竹叶青酒12种单体药材的风味解析

竹叶青酒是以汾酒为基酒,以丁香、砂仁、菊花等12种名贵中草药的浸提液为基础配制而成的露酒。对以汾酒为基酒浸泡的12种单体药材风味的解析研究,有利于明晰浸提过程中12种药材在基酒中呈香的重要性强度。本文利用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)结合气相色谱-嗅闻-质谱联用技术(Gas chromatography-olfactometry-mass,GC-O-MS)对以汾酒为基酒浸泡的12种单体药材的风味成分进行解析共发现47种呈香成分,其中萜类成分和芳香族成分呈现的药香、木香、甜香、蜂蜜香和花香是这12种药材中最重要的香气特点。该研究结果为进一步深入研究竹叶青酒药材的香气特点及竹叶青酒的风味特征提供了科学的理论基础。

竹叶青品牌战略升级于中国茶见文化底色

2月28日,竹叶青新茶早清明36天抢鲜上市,与此同时,竹叶青在四川峨眉举办平常心竹叶青--“竹叶青中国茶”品牌战略升级发布会。现场,正式宣布品牌将以“平常心”为核心价值观,定位“竹叶青中国茶”,以“竹叶青绿茶,万紫千红红茶、碧潭飘雪花茶,宝顶白芽白茶”四大品类品牌驱动,传递平常心文化,推动中国茶长盛繁荣。中国文物学会会长、故宫博物院学术委员会主任单霁翔,全国茶叶标准化技术委员会主任委员、中国茶叶流通协会会长王庆,新华网总编辑钱彤等来宾共同见证竹叶青品牌焕新时刻。

竹叶青酒易挥发成分顶空固相微萃取-气相色谱-质谱分析

采用顶空固相微萃取技术对竹叶青酒中易挥发成分进行富集,采用气相色谱-质谱联用仪对其化学组成进行分离及结构鉴定,并对其来源、保健功效进行探讨。通过考察萃取头、萃取时间、平衡及萃取温度、加盐量对萃取效果的影响,确定最佳条件为:8.0 mL酒样置于20 mL顶空瓶中,NaCl质量浓度为0.20 g/mL,在70℃条件下搅拌平衡45 min,用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头,在70℃条件下萃取45 min;在此条件下共分离得到65种化合物,确定结构56种,占总易挥发成分总量的98.16%。其中26种来自基酒(配制用白酒),另外30种来自其配制所用药材,来自药材的主要成分有:D-柠檬烯、丁香酚、石竹烯、樟脑、龙脑、莰烯、乙酸龙脑酯、α-檀香醇、古巴烯等,占总易挥发成分总量的31.63%,虽然含量相对较低,但却赋予了竹叶青酒独特的香味及一定的保健功效。

广西境内两种竹叶青蛇咬伤中毒患者的临床特点分析

目的分析广西境内两种竹叶青蛇咬伤中毒患者的临床特点,为临床诊治提供帮助。方法回顾性分析2006年6月—2012年12月我院收治的89例广西境内两种竹叶青蛇咬伤中毒患者的临床资料,其中白唇竹叶青蛇咬伤56例(占62.9%),普通竹叶青蛇咬伤33例(占37.1%)。分析其蛇体外形、临床表现以及治疗情况。结果外形上蛇体两侧腹部纵线纹白唇竹叶青蛇多为白色,普通竹叶青蛇多为黄色,两组比较差异有统计学意义(χ2=50.506,P=0.000)。白唇竹叶青蛇咬伤中毒患者均出现出血症状,12例伴有患肢局部肿胀,7例伴有轻微疼痛,凝血四项检查均出现异常;普通竹叶青蛇咬伤中毒患者6例出现出血症状,出现时间较晚,均有疼痛、患肢局部肿胀症状,6例凝血四项检查异常。伤情分级:白唇竹叶青蛇中毒轻13例,重38例,危5例;普通竹叶青蛇中毒轻27例,重4例,危2例;两组伤情分布情况比较,差异有统计学意义(z=-4.865,P<0.01)。89例竹叶青咬伤中毒患者经治疗后均治愈出院,随访,均无后遗症发生。白唇竹叶青蛇咬伤比普通竹叶青咬伤患者住院时间长、住院费用高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论白唇竹叶青蛇体两侧腹部纵线纹多为白色,咬伤病情较重,全身出血多见、早发,需及早处理;普通竹叶青两侧腹部纵线纹多为黄色,咬伤病情较轻,以患处疼痛、肿胀多见,全身出血症状少见、迟发,建议临床医学观察时间为2周。

抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2的制备

目的:制备特异性强、高纯度的抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2。方法:以竹叶青蛇毒为免疫原免疫马,试血效价达到要求后,从免疫马血浆中先提取IgG,然后酶解、过疏水柱后得到F(ab′)2片段,以免疫扩散实验检测抗体F(ab′)2片段的特异性,以小鼠中和试验测定其中和竹叶青蛇毒的能力。结果:纯化得到的F(ab′)2活性片段纯度可达90%;F(ab′)2冻干品与竹叶青蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线,在20∶1时可保护小鼠100%存活。结论:纯化得到的抗体F(ab′)2活性片段对竹叶青蛇毒具有较好的中和能力。

竹叶青蛇毒凝血酶样酶氨基酸序列报道

蛇毒凝血酶样酶可作为蛋白酶结构与功能研究的良好模型，并已广泛用于各种血栓疾病的诊断和治疗，因而测定其一级结构具有重要意义．利用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法，扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶（ＴＳＶ－ＴＥＬ１）的ｃＤＮＡ；将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，经末端终止法测定核苷酸序列，推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列．竹叶青蛇毒凝血酶样酶由２３４个氨基酸组成并含有１个位于Ａｓｎ２０的Ｎ－型糖基结合位点．竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性，其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为８４％，与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为６８％，而与牛凝血酶Ｂ链序列相似度仅为２５％．

竹叶青蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子克隆和序列比较

利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的RT PCR法 ,扩增出 5个竹叶青 (Trimeresurusstejnegeri)蛇毒丝氨酸蛋白酶的cDNAs ;将扩增的cDNA片段克隆入pGEM T载体中 ,筛选得到它们的基因 ,分别命名为TSSP 1、TSSP 2、TSSP 3、TSSP 4和TSSP 5。经末端终止法测定核苷酸序列 ,推导出 5个丝氨酸蛋白酶的全序列 ;结合纯化的蛋白酶N -末端序列测定结果 ,推导TSSP 2、 3和 4分别编码凝血酶样酶stejnobin、纤溶酶stejnefibrase 1和 2。 5个丝氨酸蛋白酶分别含有 1～ 6个N -型糖基结合位点 ,表明它们的计算分子量与纯化蛋白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成 ,而其氨基酸序列相似度在 6 0 %～ 90 %。TSSP 1和 2编码的成熟蛋白酶由 2 36个氨基酸残基组成 ,TSSP 3、 4和 5的则由 2 34个氨基酸残基组成。TSSP 1编码的蛋白酶在组成丝氨酸蛋白酶三联体催化活性中心产生了His41 Arg41的天然突变 ,这与其他自然界已发现的丝氨酸蛋白酶明显不同。

白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质

用DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法,从白唇竹叶青(Trimeresurus albolabris)蛇毒中分离纯化出具有5′-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03kDa,HPLC柱层析图谱为单一峰。该组分是一个糖蛋白,以一磷酸腺苷(AMP)为底物时,其酶活力为330.33μg Pi/(min·mg);而以二磷酸腺苷(ADP)为底物时,其酶活力为123.56μg Pi/(min·mg)。金属离子Zn2+、Fe3+和Cu2+对5′-核苷酸酶活性有显著的抑制作用,EDTA可完全抑制其酶活性。该酶的最适pH为9,最适温度为50℃。该组分还具有抑制由ADP诱导的血小板聚集的生物功能。

重组竹叶青蛇毒纤溶酶原激活剂TSV-PA体内溶栓效应观察

目的:观察重组竹叶青蛇毒纤溶酶原激活剂TSV-PA体内溶栓效应。方法:利用家兔制备的脑血栓模型。以生理盐水和尿激酶为对照,用数字减影血管造影技术观察重组竹叶青蛇毒纤溶酶原激活剂TSV-PA体内溶栓效果。结果:TSV-PA高剂量实验组(300 μg/kg)再通时间为2 h以内,TSV-PA低剂量实验组(150 μg/kg)5h以内再通。尿激酶组(2000 U/kg)再通时间为3-6 h;24 h以内生理盐水对照组没有观察到再通现象。实验动物45h后处死解剖,未观察到出血现象和其它异常现象。结论:重组TSV-PA在体内具有良好的溶栓活性。

台湾竹叶青蛇的分类学研究

[目的]研究台湾竹叶青蛇的分类地位。[方法]从GenBank数据库中获得竹叶青蛇属及外群32个个体的400 bp左右的线粒体12S基因序列,并进行同源性分析。在形态学和亲缘地理学分析的基础上,通过构建分子系统发育树,确定台湾竹叶青蛇的分类地位。[结果]从形态学上来看,台湾竹叶青蛇与其他竹叶青属蛇类存在显著差异;从分子系统发育树上来看,台湾竹叶蛇青从竹叶青属独立出来,独成一支;台湾岛与大陆地理上充分隔离,台湾竹叶青蛇独立进化。[结论]台湾竹叶青蛇可能独立成属。

竹叶青蛇咬伤的临床特点与处理方法

目的对竹叶青蛇伤临床总结分析,为临床救治提供出理论依据。方法对87例竹叶青蛇伤病例总结分析。结果临床症状以患肢肿痛为主,检查以血液病理变化为主:血小板下降,最低10×109/L,纤维蛋白原下降,最低测不到,凝血酶功能下降,凝血时间延长,14例3P试验阳性,9例D-二聚体阳性。有13例在咬伤后72h血液才发生明显病理变化。结论竹叶青蛇伤血液变化普遍呈纤维蛋白原下降,凝血功能下降,血小板减少程度可帮助判断病情危重应注意迟发性血液病理变化。

竹叶青毒蛇伤致DIC临床特征及其本质的探讨

竹叶青(青竹蛇)是我国南方常见的毒蛇之一,栖生在丘陵山区的青草灌木丛中,早晚活动,归属蝮亚科,其蛇毒主要是血循毒素,以消耗性的凝血障碍和纤溶征为主要的病理过程[1].本文通过分析竹叶青毒蛇伤致DIC的临床特征及救治措施,进而对其致DIC的本质进行初步探讨.

白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析

通过分析多种已知的毒蛇蛇毒类凝血酶（SVTLEs）基因序列同源性，以保守的N和C末端氨基酸序列设计引物，克隆得到白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）SVTLE基因并分析其序列。以毒腺总RNA为模板进行RT—PCR，纯化并克隆至pMD18-T。结果表明，该酶基因大小为777bp；推测出其相应氨基酸序列含258个氨基酸残基，分子量为28．02kD，pI值为6．07；其3个可能糖基化位点为NDT103～105、NNS121～123和NRT251～253；与其它毒蛇的已知SVTLEs基因比较分析，推测出其含6对二硫键即Cys31—162、Cys50-66、Cys98．256、Cys142—210、Cys174—189和Cys200—225；其催化活性中心氨基酸残基为His65、Asp110和Ser204。分子进化树分析表明，毒蛇SVTLEs一级结构的进化具有一定种属特征，可为蛇的系统分类提供参考。

竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒五种磷脂酶A_2的分离纯化和氨基酸序列分析

用超细SephadexG 75凝胶色谱和C4反相高效液相色谱从竹叶青(Trimeresurusstejnegeri)蛇毒中分离纯化5种磷脂酶A2,并分别命名为PLA2 Ⅰ(SWISS PROT,P82892)、Ⅱ(SWISS PROT,P82893)、Ⅲ(SWISS PROT,P82894)、Ⅳ(SWISS PROT,P82895)、Ⅴ(SWISS PROT,P82896).SDS PAGE测定它们的分子量分别为14.0、15.8、15.0、14.0和14.0kDa.等电聚焦电泳测得PLA2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ呈碱性,等电点大于8.8;PLA2 Ⅳ和Ⅴ呈酸性,等电点分别为5.2和4.7.PLA2 Ⅳ和Ⅴ有水解卵磷脂活性.用自动Edman降解法测定了PLA2 Ⅴ的全部氨基酸序列和PLA2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的N 端部分氨基酸序列.PLA2 Ⅴ由122个氨基酸残基组成,有14个Cys,并与其它来源的PLA2的氨基酸序列进行了比较.

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)基因的克隆及序列分析

为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础,试验以竹叶青蛇毒毒腺的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增L-氨基酸氧化酶(LAAO)基因,经克隆和测序并通过Blast分析。结果表明:LAAO基因与GenBank中公布序列编码的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因的序列(AY277739)同源性达98.23%。

基于蛋白质组学技术对竹叶青蛇毒染毒家兔模型血清蛋白质变化的检测及其意义

目的:探讨竹叶青蛇蛇毒模型中血清蛋白的表达,阐明竹叶青蛇蛇毒在染毒过程中标志蛋白的表达情况。方法:将12只雌雄不限日本大耳兔随机分为假手术组和模型组,每组6只。模型组家兔给予20 mg·kg^(-1)竹叶青蛇毒肌肉注射,假手术组家兔给予等量生理盐水注射;4 h后,2组日本大耳兔用戊巴比妥钠麻醉后心脏采血,分离血清,采用绝对定量同位标记(TMT)联合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-TMS)定量蛋白组学技术对2组家兔血清进行差异蛋白分析,采用Proteome Discover 2.4等数据库筛选差异蛋白。结果:假手术组与模型组在主成分分析(PCA分析)坐标图上分成明显2簇;差异蛋白鉴定分析共鉴定分析出199个差异蛋白,其中表达上调的蛋白有139个,上调蛋白前5位分别为骨骼肌快肌肌钙蛋白Ⅰ(TNNI2)、小清蛋白α(PV)、烯醇化酶2(ENO2)、肌红蛋白(MB)和肌酸激酶(CK);表达下调蛋白有60个,下调蛋白前5位分别为载脂蛋白C1(APOC1)、扣带蛋白(CGN)、载脂蛋白CI(APOCI)、前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)和转钴胺素蛋白Ⅰ(TCN1)。基因本体(GO)分析,参与胞外调节功能过程的差异蛋白最多,其次为钙离子调节和蛋白降解调节过程蛋白。结论:竹叶青蛇蛇毒染毒过程中抗原加工及呈递功能有关的蛋白表达水平变化明显,其中CK和溶质载体家族16成员1(SLC16A1)可以作为染毒后损伤的候选靶标。

大剂量糖皮质激素联合抗蛇毒血清治疗竹叶青蛇伤致DIC的疗效

目的观察大剂量糖皮质激素联合抗蛇毒血清在治疗竹叶青蛇伤致DIC中的疗效。方法57例竹叶青蛇伤致DIC患者按单盲随机法分为两组,对照组28例,治疗组29例。对照组予常规综合治疗+抗蝮蛇血清;治疗组在对照组基础上加用甲基强的松龙1000m g/d,观察两组疗效及凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)和血小板(PLT)的恢复时间。结果治疗组总有效率96.6%,对照组总有效率75.0%,两者差异有显著性(P<0.05);治疗组PT、Fg、PLT与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。结论大剂量糖皮质激素联合抗蛇毒血清治疗竹叶青蛇伤致DIC可明显缩短凝血指标恢复时间及提高疗效。可以对竹叶青蛇毒起较好的中和作用,取得满意的临床治疗效果。

热毒宁注射液对竹叶青蛇咬伤患者INR、PT以及APTT等凝血指标水平变化的影响

目的研究热毒宁注射液(RI)对竹叶青蛇(TS)咬伤患者国际标准化比率(INR)、凝血酶原时间(PT)以及活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)等凝血指标水平变化的影响。方法选择该院2010年7月至2013年7月收治的TS咬伤患者300例进行观察。分2组,对照组实施常规治疗,观察组另加RI进行治疗。对比两组症状改善情况,疗效以及INR、PT和APTT凝血指标变化情况。结果观察组肿胀消退时间是(127.8±56.2)h,止痛时间是(5.3±2.7)h,住院时间是(3.8±2.7)d;较对照组的(150.3±83.4)h、(11.5±6.1)h、(5.8±4.4)d,明显更短。两组病患治疗后INR,PT以及APTT均出现延长,且观察组延长程度低于对照组。观察组痊愈率为90.00%(135/150),愈显率为98.00%(147/150),较对照组的67.33%(101/150),84.67%(127/150)明显更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RI治疗TS咬伤,疗效显著,能有效缩短症状改善时间,抑制因TS咬伤引起的凝血指标延长。