笛鲷属(Lutjanus)鱼类线粒体16S rRNA基因序列比较及系统学分析

对笛鲷属9种鱼的线粒体DNA16S rRNA基因片段进行了PCR扩增,扩增产物经纯化后测序,得到了长度为561bp的分析序列。结合GenBank中的另外9种笛鲷的16S rRNA同源序列计算得出A、T、G、C的含量平均为28.5%、22.1%、23.6%和25.8%,AT含量稍高于GC含量,18种笛鲷碱基组成差异不大。利用MEGA3.1软件对所得序列进行比对后检测到72个变异位点,其中包括简约信息位点44个,在变异位点中75.61%的碱基替换是由于发生了转换,转换/颠换平均为3.1︰1。计算了种间的遗传距离,结果表明,序列差异在0.0193-0.0680之间,其中勒氏笛鲷和金焰笛鲷、勒氏笛鲷和金带笛鲷的序列差异最小,而红鳍笛鲷和金焰笛鲷、红鳍笛鲷和画眉笛鲷的序列差异最大。选用高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外群,利用NJ法构建了分子系统树,结果表明:本研究中的9种南海笛鲷与其它9种笛鲷进化关系较远;并且南海9种笛鲷相互之间仍然保持着着相对较远的遗传距离,遗传多样性较好。

勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)线粒体DNA全序列的测定与分析

通过长距PCR法(long-PCR)测得勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)全长16505bp的mtDNA基因组全序列(GenBank序列号:EF514208).序列分析结果表明,南海海域勒氏笛鲷的mtDNA基因组全序列结构组成与其他硬骨鱼类的结果较为一致,由13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和非编码区组成.序列比对显示,勒氏笛鲷和蓝点笛鲷(L.rivulatus)所属的笛鲷科(Lutjanidae)与黑带鳞鳍梅鲷(Pterocaesiotile)所属的梅鲷科(Caesionidae)的亲缘关系密切.勒氏笛鲷全序列虚拟酶切结果证明了以往纯化mtDNA的限制性酶切长度多态性分析(mtDNA-RFLP)所得结果的可靠性;所开发的长距PCR引物能快速获取足量的mtDNA大片段进行限制性酶切长度多态性分析,可应用于物种辨别和群体分析.

6种笛鲷属鱼类Cyt b基因片段序列的比较

采用聚合酶链式反应直接测序法,获得紫红笛鲷(Lutjanusargentimaculatus)、白星笛鲷(L.stellatus)、千年笛鲷(L.sebae)、勒氏笛鲷(L.russelli)、红鳍笛鲷(L.erythropterus)5种笛鲷属鱼的线粒体细胞色素b(Cytb)425bp序列,并结合基因库中的斜带笛鲷(L.decussatus)Cytb同源序列进行比较分析,共发现88个核苷酸位点存在变异(20.7%)。用MEGA2.1软件中的Pairwisedistance工具计算了6种笛鲷属鱼类的相对遗传距离,表明6种笛鲷属鱼类的序列差异在0.096—0.129之间,其中红鳍笛鲷和紫红笛鲷序列差异最大为0.129,千年笛鲷与红鳍笛鲷的序列差异最小为0.096;序列变异的转换/颠换比值较低,平均只有2.160。

从细胞色素b基因序列探讨笛鲷属的分子系统发生关系

测定了9种中国南海的笛鲷属鱼类的细胞色素b基因的部分序列,结合来自GenBank中1种分布于菲律宾和9种分布于美国大西洋的笛鲷属鱼类的相应同源序列,用邻接法和最大简约法构建分子系统树。结果显示:红鳍笛鲷(Lutjanuserythropterus)与红笛鲷(L.sanguineus)之间的同源序列碱基差异百分率只有0.32%,支持二者是同种异名的观点;中国南海的笛鲷属鱼类间的平均碱基差异要高于美国大西洋笛鲷属鱼类。在MP和NJ树中,美国大西洋笛鲷表现为亲缘关系较近,来源于中国南海的笛鲷鱼类相对集中在树的基部,分歧较大。这与所研究的笛鲷地理分布和地理隔离基本相一致,同时也说明中国南海笛鲷分化较早并且分歧较大。

笛鲷属线粒体基因组编码序列的系统进化分析能力评估

运用通用引物长距PCR(Long-PCR)和常规PCR相结合的方法测定了鲈形目笛鲷科的4种笛鲷属鱼类(孟加拉笛鲷、四带笛鲷、千年笛鲷和马拉巴笛鲷)和军曹鱼科的军曹鱼线粒体DNA基因组全序列(GenBank序列号分别为FJ171339,FJ416614,FJ824741,FJ824742和NC_011219),得出所用全序列测定体系的方法通用性较强,操作简单。线粒体基因组的比对分析表明,测定的mtDNA基因组的绝大部分区段与GenBank中现有的脊椎动物的序列有较高的同源性。以军曹鱼外群结合GenBank中近缘笛鲷鱼类(勒氏笛鲷、蓝点笛鲷和黑带鳞鳍梅鲷)进行的聚类分析中,勒氏笛鲷与黑带鳞鳍梅鲷的聚类关系近于同属物种,与形态学分类存在矛盾。通过单个基因和基因拼接序列比较,综合考虑邻位连接法构建系统进化树的置信度和序列的信息量,对13种蛋白质编码基因在属内种间的系统进化分析能力进行了评估,将基因分成不同的4等:很好的为ATPase6和cox2;好的序列为ND2和cox1;差的为ND6、ND3和ATPase8;包括Cytb在内的其余6种基因为中等。分析还揭示出序列长度的增加可以提高系统进化树的置信度,且属内物种间比较时序列长度的影响小于高级阶元。

4种笛鲷属鱼类mtDNA的RFLP研究

用RFLP(限制性片段长度多态性,Restriction fragment length polymorphism)技术研究了红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus Bloch、紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus Forskal、勒氏笛鲷Lutja-nus russelli Bleeker和约氏笛鲷Lutjanus johni Bloch的遗传多样性关系,检测到4种笛鲷的分子标记。通过差速离心、核酸酶消化、苯酚抽提,从4种笛鲷肝脏组织中分离纯化线粒体DNA(mtDNA),用19种5到6碱基对的限制性内切酶进行单酶、双酶和部分酶切,琼脂糖凝胶电泳,进行了RFLP分析,构建了4种笛鲷mtDNA的物理图谱。红鳍笛鲷、紫红笛鲷、勒氏笛鲷和约氏笛鲷的mtDNA大小分别为17.36±0.09kb、17.58±0.08kb、17.50±0.18kb和17.56±0.12kb。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间平均mtDNA多态度π为0.106 2,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.130 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.151 5,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtD-NA多态度π为0.130 3,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.119 5,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.139 4。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间净遗传距离Pnet为0.102 0,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.128 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.149 1,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.127 0,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.115 7,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.137 8。

6种笛鲷属鱼类线粒体165SrRNA基因片段的序列比较

对笛鲷属(Lutjanus)的紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白星笛鲷(Lutjanus stellatus)、千年笛鲷(Lutjanus sebae)、勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)、红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)线粒体DNA 16SrRNA基因片段进行了PCR扩增和测序，得到长度约418bp的序列。结合GenBank中斜带笛鲷(Lutjanus decussatus)该区段的16SrRNA序列，用(Clustal_X排序软件进行16SrRNA序列的对位排列。通过Mega2．1软件对所得线粒体16SrRNA片段序列进行比较，共检测53个碱基存在变异，其中包括21个简约信息位点，并用“PairWise distance”计算了各属间的相对遗传距离，结果表明，其序列差异(转换+颠换)在0．027～0．083，其中勒氏笛鲷与斜带笛鲷的序列差异最小，红鳍笛鲷与勒氏笛鲷的序列差异最大。以高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外类群，采用Mega2．1软件中的“Neighbore-Joining'’法得到唯一1个分子系统树，系统树各分支的置信度南“Bootstrap”1000循环检验。结果表明，6种笛鲷鱼类聚成明显的3个分支，第1个分支，包括勒氏笛鲷、斜带笛鲷和白星笛鲷；第2个分支，包括紫红笛鲷；第3个分支，包括红鳍笛鲷和千年笛鲷。

基于COⅠ基因的中国及邻近海域部分笛鲷属鱼类DNA条形码研究

笛鲷属(Lutjanus)鱼类经济价值高,物种数量多,但外部形态保守,传统分类鉴定困难。为了解中国笛鲷属鱼类的物种多样性状况,测定了中国沿海19个地点11种笛鲷73个样本线粒体COⅠ基因5'端序列,并与从GenBank下载中国及邻近海域69条同源序列进行DNA条形码分析。研究表明,勒氏笛鲷(L. russelli)、金焰笛鲷(L. fulviflamma)、奥氏笛鲷(L. ophuysenii)、约氏笛鲷(L. johni)、蓝点笛鲷(L. rivulatus)、五线笛鲷(L. quinquelineatus)、千年笛鲷(L. sebae)、紫红笛鲷(L. argentimaculatus)、白斑笛鲷(L. bohar)、马拉巴笛鲷(L. malabaricus)、黄笛鲷(L. lutjanus)、印度笛鲷(L. indicus)、画眉笛鲷(L. vitta)、星点笛鲷(L. stellatus)、四带笛鲷(L. kasmira)、驼背笛鲷(L. gibbus)、焦黄笛鲷(L. fulvus)、红鳍笛鲷(L. erythopterus)等18种笛鲷142条COⅠ序列组成18个自展数据支持率(bootstrap)为99%～100%的单系分支,分支间平均遗传距离14.4%(2.9%～21.8%)约为分支内平均遗传距离0.17%(0～0.6%)的85倍,其中10种笛鲷独立成支,支持其物种有效性。勒氏笛鲷分成2小支,小支间平均遗传距离(2.9%)是小支内平均遗传距离(0.5%)的5.8倍,未满足"10×法则",其准确的物种分类地位尚待明确。印度笛鲷与勒氏笛鲷、画眉笛鲷与奥氏笛鲷出现混杂,推测从GenBank下载的印度笛鲷序列KF830898和KF830905可能来自勒氏笛鲷;画眉笛鲷序列KU943888可能来自奥氏笛鲷。中国近海星点笛鲷和蓝点笛鲷混杂且种间遗传距离仅为2.1%,接近一般种内遗传距离2%;红鳍笛鲷和马拉巴笛鲷遗传距离种间(0.3%)与种内(0.2%～0.3%)相当,且形态相似,推测是同一物种,也不排除它们存在种间杂交和为近期分化物种的可能。

紫红笛鲷线粒体全序列与笛鲷属鱼类分化年代的贝叶斯分析

利用常规PCR未纯化产物直接测序的方法,获得紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)全长为16 543 bp线粒体DNA全序列,GenBank登录号为JN182927。结合GenBank中的已有数据比较分析表明:紫红笛鲷与笛鲷属(Lutjanus)线粒体基因组成基本一致,符合脊椎动物的特征,各基因间进化速率差异显著;13个蛋白编码基因拼接序列贝叶斯建树的后验率显著高于单基因或全序列,更适用于笛鲷属的贝叶斯法系统分化分析和年代推断;13个蛋白编码基因及其拼接序列进行的系统进化分析均支持紫红笛鲷与勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)及海鸡母笛鲷(Lutjanus rivulatus)亲缘关系较近;基于13个蛋白编码基因拼接序列的贝叶斯松散分子钟推算出笛鲷属鱼类两个主要支系大约在61.5Ma前古新世的达宁阶与蒙蒂阶交界时期发生分化。

9种常见笛鲷微卫星位点筛选与遗传多样性分析

利用从勒氏笛鲷Lutjanus russelli基因组文库中筛选得到37对微卫星引物对笛鲷属9个习见种红鳍笛鲷L.erythropterus、紫红笛鲷L.argentimaculatus、星点笛鲷L.stellatus、约氏笛鲷L.johnii、千年笛鲷L.sebae、金带笛鲷L.fulvus、金焰笛鲷L.fulviflamma、画眉笛鲷L.vitta与奥氏笛鲷L.ophuysenii的微卫星位点进行筛选和分析。9个种都能检测到的微卫星位点有10个,部分种能检测到的有13个。9种笛鲷Hardy–Weinberg平衡下的平均期望杂合度在0.730―1.000,平均观测杂合度在0.716―0.915,偏离指数(D)为-0.002―-0.214。微卫星位点杂合度的分析表明目前笛鲷属鱼类存在较高的遗传多样性水平。另发现9个种的笛鲷都出现了杂合子缺失的情况,缺失的原因有待于进一步的研究予以解释。

AFLP技术在笛鲷的仔鱼鉴定及其分类学上的研究

以南沙群岛采获的勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)、黄笛鲷(Lutjanus lutjanus)、红笛鲷(Lutjanus sanguineus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、线纹笛鲷(Lutjanus lineolatus)、画眉笛鲷(Luqanus vitta)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabarius)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)、约氏笛鲷(Luqanus johni)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)11种笛鲷属的后期仔鱼为材料，进行了基因组DNA的AFLP(扩增片段长度多态性)研究，通过笛鲷仔鱼和成鱼的AFLP电泳图谱的比较分析，将这11种笛鲷属的仔鱼成功分开．研究表明，最适合的AFLP引物组合是E+AGC／M+CAA，由这11种笛鲷共扩增出132AFLP位点，每种笛鲷的AFIP条带数为43～69，在这11种笛鲷中，共享的AFLP条带数仅为7，同一种笛鲷仔鱼和成鱼AFLP遗传相似度在90％以上．根据这11种笛鲷的Nei遗传距离对Neigkboring系统进行进化分析，并且与传统的笛鲷形态分类进行了比较．分子生物学可以阐释笛鲷属鱼类的系统进化和遗传亲缘关系，对传统形态分类学加以完善和补充．

红鳍笛鲷亲鱼培育及产卵技术研究

采用控温、营养强化的方法培育红鳍笛鲷(Lutjanuserythropterus)亲鱼 ,并结合激素诱导使其在1周年内每个月不间断产卵。实验亲鱼454尾 ,培育成活率为96% ,共采卵147150×104粒 ,平均每尾雌鱼年产卵量为541.0×104粒 ,人工催产卵的受精率为40 %～86.2 % ,自然产卵的受精率为68.3%～91.2%。

川纹笛鲷染色体核型、银染和C-带

实验采用植物血凝素、秋水仙碱腹腔注射,肾细胞直接制片法分析了川纹笛鲷Lutjanus sebae染色体核型、Ag-NORs和C-带。结果表明:1)川纹笛鲷二倍体染色体数2n=48,核型公式为:2n=48t,NF=48;在第1对染色体靠近着丝粒部位有明显的次缢痕。2)染色体经快速银染后,Ag-NORs的数目在不同细胞中表现出多态性,数目1—4个,2个Ag-NORs的频率最高(占79%)。在分裂相中,第1对t染色体近着丝粒的次缢痕区均出现2个银染位点(Ag-NORs阳性),且未见Ag-NORs的联合现象。3)大多数染色体的着丝粒区显示出1个深浅不同的C-带,在第1对染色体的随体区域分布有大量的结构异染色质,表现C-带强阳性。讨论了鱼类核型演化规律和Ag-NORs、C-带的发生机制,以及川纹笛鲷的进化地位。

5种笛鲷mtDNA及Cytb基因片段的RFLP比较

采用线粒体DNA限制性片段长度多态性分析(mtDNARFLP)和线粒体DNA的细胞色素b基因(Cytb)的部分序列扩增限制性片段长度多态性分析(mtDNAPCRRFLP)两种方法,对笛鲷属5种鱼类进行种间系统发育的比较研究,结果显示:(1)画眉笛鲷依照其形态学上体侧条带颜色差异,可分为褐带画眉笛鲷和黄带画眉笛鲷两个种;(2)千年笛鲷和星点笛鲷、褐带画眉笛鲷和黄带画眉笛鲷、金带笛鲷和金焰笛鲷之间遗传距离相对较近;(3)两种分析方法都可以为种的区分提供方便有效的分子标记;(4)两种分析方法在构建发育系统树上不完全一致。本文从mtDNA角度深入研究了南海海域笛鲷的系统发生,表明了mtDNA作为一种广泛应用的分子标记的实用性,同时也有一些潜在问题需要进一步研究。

川纹笛鲷消化道优势菌群PCR-DGGE指纹图谱比较分析

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术(DGGE)对集约化海水网箱养殖川纹笛鲷(Lutjanus sebae)的消化道胃壁、胃内容物、肠壁、肠内容物优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示,川纹笛鲷消化道存在着丰富多样的细菌群落,对DGGE指纹图谱聚类分析表明菌群组成相似度高于55%,其中胃内容物及胃壁细菌组成相似度最高(90%),这可能与摄食饵料在消化道推移有关;而胃壁与肠壁相似度相对最差,可能反应了由于生理环境不同引起的宿主差异性。通过建立川纹笛鲷消化道16SrDNA-DGGE指纹图谱及比较分析,为澄清川纹笛鲷消化道微生物区系奠定了基础。

红鳍笛鲷外周血细胞的显微结构观察

报道了红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)外周血细胞的显微结构,血涂片经过Wright染色液染色,可区分出:红血细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等5种血细胞,无嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。白血细胞中:血栓细胞体积最小,单核细胞体积最大;血栓细胞数目最多,嗜中性粒细胞和单核细胞数目最少;淋巴细胞有大中小3种类型:大淋巴细胞、中淋巴细胞和小淋巴细胞。此外,在外周血液中还观察到少量幼稚的红细胞,偶而可见正在分裂的红细胞,提示红细胞也可在外周血直接分裂。

广东沿海笛鲷科、鲷科鱼类的细菌性疾病

近几年,广东沿海养殖的海鱼品种有由过去的重点养石斑鱼转移到笛鲷科、鲷科鱼类的趋势,网箱养殖的方式虽继续发展,简单的海水泥塘和半咸淡水塘的养殖则发展更快。笛鲷科、鲷科类尽管没有石斑鱼名贵,但其肉质鲜嫩,病害较少,对饵料和环境要求较低,特别是对盐度要求不严,其市价亦较易为国内一般家庭接受,故养殖量不断增加。然而由于高密度集约化养殖所带来的多种负因子影响,笛鲷和鲷类的疾病也变得严重起来,其中细菌性疾病更是以其死亡率高、从发现到死亡的时间短而使生产蒙受重大的损失。我们于1987年起便对这些疾病开展了鱼病调查、病因病理研究和防治研究。本文着重介绍所发现的各种细菌性病的一般情况。

红鳍笛鲷的人工繁育

红鳍笛鲷属鲈形目、笛鲷科鱼类，又称红笛鲷，广东地方俗称红鱼、红鸡，福建地方俗称：红曹，台湾地方俗称：横笛鲷、赤海鸡、红鸡仔、红沙鱼等。

千年笛鲷染色体核型研究

采用活体分离鱼的肾细胞,与PHA、秋水仙碱相作用、经Giemsa染色、空气干燥法制片,对千年笛鲷(Lutjanus sebae)的染色体核型进行分析.结果表明千年笛鲷染色体数目2n=48,核型公式为2N=46t+2sm,NF=50.本方法简便、容易重复、适用于其它鱼类染色体核型的研究.

笛鲷属鱼类DNA分子条码、系统进化和成种机制

对20种笛鲷鱼类的72条DNA条码进行聚类分析,筛选出采自南海的13种笛鲷鱼类的典型样本;利用这13个典型样本的线粒体DNA的3个基因(COⅠ,COⅡ和Cytb)全序列和核DNA的2个基因(RAG1和RAG2)的部分序列组合而成的5389bp,对这13个物种进行了系统进化关系的推测.数据表明,分子进化关系与基于Allen的形态学分类系统所强调的体色、体侧带型特征相关性明显.分布在浅水的黄体笛鲷(Lutjanus kasmira,L.bengalensis和L.quinquelineatus)和分布在深水的红体笛鲷(L.malabaricus,L.erythropterus和L.sebae)分别聚在一起,因此推测,作为缺乏地理隔离的岩礁鱼类,笛鲷的成种机制可能是通过体色与视觉系统同步分化驱动物种分化.