靶向第二代测序技术在病原体检测中的作用

病原学的早期准确识别对于感染性疾病的诊治至关重要。随着基因检测技术的发展,第二代测序技术正被逐步应用于临床病原体的检测。作为第二代测序技术的一个分类,靶向第二代测序技术能选择性地扩增或富集感兴趣的基因组区域,再进行大规模测序,快速准确地检出目标病原体。本文对靶向第二代测序技术在感染性病原体检测中的应用现状进行综述,讨论靶向第二代测序技术作为感染性疾病诊断工具的应用前景。

第二代测序技术下双歧杆菌三联活菌辅助治疗重症肺炎患者的价值研究

目的研究第二代测序技术(NGS)下双歧杆菌三联活菌(BDT)辅助治疗重症肺炎患者的价值。方法选择2020年12月—2022年12月石家庄市人民医院收治的重症肺炎患者,共100例,按照统计学随机法将其分为对照组、实验组,均50例,对照组应用经验性抗感染治疗,实验组应用NGS对患者肺泡灌洗液行病原学分析,根据检出的病原菌做针对性抗感染治疗,另加用BDT辅助治疗。对比观察两组疗效;对比两组治疗前后肠道益生菌(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌,粪肠球菌)、炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)]变化及肺部感染情况;对比治疗后两组肺部病原菌检出阳性率。结果治疗后,实验组治疗总有效率及双歧杆菌、嗜酸乳杆菌,粪肠球菌计数明显高于对照组(P<0.05),肺部感染评分、肺部病原菌检出阳性率及IL-6、PCT、CRP明显低于对照组(P<0.05)。结论NGS有助于指导重症肺炎患者的抗感染治疗,另加用BDT辅助治疗重症肺炎可改善患者肠道菌群、减轻肺部感染的临床效果。

宏基因组第二代测序技术在狂犬病诊断中的应用

目的:总结宏基因组第二代测序技术(mNGS)诊断狂犬病临床应用价值。方法:回顾性分析广东省东莞市横沥医院1例和文献报告3例狂犬病诊疗资料。结果:4例患者唾液或脑脊液标本的mNGS检测狂犬病毒结果均为阳性,其中3例患者同时进行了狂犬病毒PCR检测亦为阳性。结论:唾液和脑脊液标本行mNGS检测为临床确诊狂犬病提供依据。

探讨宏基因组学第二代测序在肺部感染病原体检测中的临床价值

目的:探讨肺泡灌洗液行宏基因组学第二代测序(mNGS)在肺部感染患者中致病病原微生物检测的临床价值。方法:回顾性分析于2021年4月—2022年8月在我院呼吸与危重症医学科收治的87例肺部感染患者的临床数据,所有患者均进行常规的细菌真菌涂片+培养方法,同步行电子支气管镜检查收集肺泡灌洗液使用mNGS技术进行病原体检测。结果:在87例患者中,mNGS技术对病原微生物的检出率明显优于常规方法(P<0.05)。共检测到47例细菌、12例真菌、11例病毒、2例支原体、2例衣原体,其中最多的是结核分枝杆菌,共检测到19例(21.84%)。从细菌的检出率来看mNGS技术对肺部感染患者肺泡灌洗液中的病原微生物检出率显著高于常规涂片+培养方法。结论:mNGS技术在肺部感染患者肺泡灌洗液中的病原微生物检出率显著高于常规涂片+培养方法,并且能检出的病原体微生物种类也更广泛,在临床明确病原体和治疗中具有较高的指导作用。

宏基因组学第二代测序技术与传统实验室微生物培养在支气管扩张病原学诊断中的比较

目的研究宏基因组学第二代测序技术(mNGS)与传统实验室微生物培养在支气管扩张病原学诊断中的价值,为临床提供参考。方法选取百色市人民医院2021年9月至2022年10月收治的170例支气管扩张症患者为研究对象进行回顾性分析,根据检测方法不同分为mNGS组(65例)和实验室培养组(105例)。根据患者自我选择用药情况将需调整抗生素使用的43例患者分为mNGS1组(22例)、传统培养组(12例)及经验组(9例)。收集其经纤维支气管镜防污染-肺泡灌洗液的常规微生物检查结果,分离培养检查结果及临床宏基因学组检测结果等临床资料,比较实验室培养与mNGS检测阳性率及不同用药状态下患者转归情况。结果mNGS检测阳性率高于实验室培养(P<0.05)。mNGS1组患者平均住院时间短于传统培养组、经验组,mNGS1组患者白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白及白细胞介素-6水平低于传统培养组、经验组(P<0.05)。结论mNGS在支气管扩张病原学诊断中具有一定优势,诊断阳性率更高,对患者经验用药具有一定帮助,能够缩短住院时间,降低炎症因子水平,值得临床应用。

第二代测序技术的发展及应用

基于双脱氧核苷酸末端终止测序法的第一代测序技术,由于其通量低、成本高的缺点,逐步被第二代测序技术取代。基于高通量测序的第二代测序技术由于其通量大、可定量、成本低廉的优点,在各个领域方面的研究越来越广泛。该文首先详细介绍了以454测序、Solexa测序和SOLiD测序为代表的第二代高通量测序技术的原理、方法,并将以这3种测序方法为基础构建的3种测序平台的优缺点、适用研究对象、测序精确度等进行了对比总结,然后对第二代测序技术目前在土壤、沉积物、人体、海洋和污水方面等领域的应用情况进行了介绍。最后,对第三代测序技术的发展作了相应展望。

第二代测序技术检测1例假肥大型肌营养不良家系Dystrophin基因突变

目的探讨第二代测序(NGS)技术检测假肥大型肌营养不良患者的可行性。方法用NGS技术检测1例假肥大型肌营养不良(DMD)患者,并用Sanger测序技术对患者基因型进行验证,同时检测家系其他成员基因型。结果 NGS技术结果表明,该患者DMD基因编码区第55号外显子存在1个移码突变c.8087delT(p.Leu2696ArgfsX30),为致病性突变;同时该患者还存在3个错义突变p.Arg2937Gln、p.Arg1745His和p.Asp882Gly,均为已知多态性变异;Sanger测序技术进一步证实了该点突变的存在,同时发现患者母亲为该突变的携带者,患者父亲和妹妹未见该突变。结论 NGS技术可用于DMD基因突变检测,为DMD临床遗传咨询和治疗提供了依据。

第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序（NGS）技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者（Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4）和3名表型正常者（Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2）的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C（p.S228P）杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿（Ⅳ1）CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.

第二代测序技术与无创产前诊断

孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的发现开辟了无创产前诊断的新篇章,借助各种分子诊断技术针对cffDNA进行胎儿染色体疾病、遗传性疾病以妊娠相关疾病的研究迅速成为热点。以高通量、自动化为显著特征的第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术诞生,极大加速了cffDNA的实验室研究进展。目前基于NGS平台,建立的胎儿21/18/13三体综合征的产前基因诊断技术已应用于临床,其他如性染色体非整倍体、双胎妊娠染色体非整倍体、胎儿染色体结构异常疾病以及孟德尔单基因遗传病的研究也因NGS的出现获得了显著的进步。本文就NGS的基本原理、cffDNA的生理特性及NGS在无创产前诊断研究中的进展进行综述。

利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C>G(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。

基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测试剂申报资料要求

该文旨在阐述基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测试剂的申报情况及检测试剂注册申报资料的技术要求。通过介绍该类试剂的申报情况,分析该类试剂的注册申报资料中常见问题,对检测试剂的预期用途、参考品和质控品的设置、分析性能评估、参考区间的研究及临床评价等部分注册申报资料要求进行解析。

宏基因组学第二代测序技术对比传统实验室微生物培养在脓毒症病原学诊断中的优势

目的通过对宏基因组学第二代测序技术(mNGS)获得的病原体与实验室培养结果进行对比,了解mNGS在脓毒症病原学诊断中的优势及其临床指导意义。方法将入选的脓毒症患者的标本(肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、胸水、腹水、分泌物等)同时送检mNGS和实验室细菌培养,对结果进行对比分析,评价mNGS在脓毒症病原学诊断方面的临床价值。结果mNGS的阳性率为78.9%;细菌培养的阳性率为40.4%(P<0.05)。通过mNGS共检出致病病原体57种,其中细菌31种,真菌16种,病毒7种,非典型病原体3种;细菌培养共检出病原体24种,其中细菌18种,真菌6种。以培养结果为金标准,mNGS的敏感度为76.2%,特异度为29.8%,阳性预测值为42.3%,阴性预测值为64.8%。根据病原学结果的抗生素调整将患者分为三组:按mNGS调整为mNGS组、经验性调整为经验组、按培养结果调整为传统培养组。mNGS组ICU住院时间更短(P<0.05),培养组降钙素原下降更明显(P<0.05)。结论mNGS在感染性疾病病原体的诊断方面较传统微生物培养时间更短,阳性率更高,在少见病原体、罕见病原体诊断方面有显著优势,可缩短患者ICU住院时间。

基于第二代测序技术的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)贝壳丝状体附生菌群研究

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)贝壳丝状体黄斑病给育苗产业造成危害,但目前对健康状态下的菌群结构及其发病后变化仍缺乏认识。本研究基于第二代测序技术和16S r RNA序列分析,对健康和患病丝状体的细菌组成与变化进行比较。测序共产生1.6Gb配对末端序列,获得了第一个高通量的条斑紫菜贝壳丝状体细菌群落数据集。通过数据分析共识别出7,833种可操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs),比对确定为18个细菌门。相对于健康样本,黄斑病丝状体样本的微生物多样性显著增加。主坐标分析和非加权组平均法(unweighted pair group method using arithmetic average,UPGMA)聚类均将健康和黄斑病丝状体分成不同的组,且健康组样本间的距离明显小于黄斑病组。上述结果说明,健康贝壳丝状体保持着相似的微生物群落结构,而患病后的丝状体则发生了不同的变化;健康样本和黄斑病样本组间差异显著的细菌属有39个,其中29个在健康样本中的相对丰度明显高于病患组样本。本研究从菌群生态角度分析了健康贝壳丝状体微生物菌群结构、发病后菌群的变化及其对丝状体生长的潜在作用,为丝状体病害的检测和预防提供有价值的信息。

质谱分析及第二代测序技术检测白血病微小残留病的研究进展

白血病是一种造血干细胞异常增殖与发育的进行性恶性疾病,其治疗的选择性十分有限,而微小残留病(MRD)已成为白血病复发的直接原因,也是患者生存的重要预后因素,因此MRD的检测有利于对白血病患者进行疾病状态评估、疗效判定、指导治疗及预测复发。临床广泛使用流式细胞术对MRD进行检测,但其检测能力较低,而新兴技术的快速发展则有望改善白血病患者的MRD检测,如质谱分析及第二代测序技术可以同时检测多个基因,对MRD的检测均具有较高的敏感性。本文对质谱分析及第二代测序技术检测白血病MRD的相关优点与局限性进行综述。

目标区序列捕获和第二代测序技术在Duchenne型肌营养不良基因诊断中的应用

目的应用目标区序列捕获和第2代测序技术对Duchenne型肌营养不良患者进行基因检测,验证该方法的敏感度和特异度。方法应用目标区序列捕获和第2代高通量测序技术对19例临床诊断为Duchenne型肌营养不良患者进行基因检测,用Sanger法对8个微小突变患者样本进行测序验证。结果 19例患者均发现遗传病因,大片段缺失11例,微小突变8例,经Sanger法测序验证。其中3个微小突变为首次发现的新突变。结论目标区序列捕获和第2代测序技术可以1次检测DMD基因几乎全部的突变类型,极大地提高了检测效率,该方法敏感度高、特异性强,具有良好的临床应用前景。

宏基因组学第二代测序技术对比传统微生物培养在慢性子宫内膜炎病原学诊断中的优势

目的通过对比宏基因组学第二代测序技术(mNGS)与传统微生物培养在慢性子宫内膜炎病原学检测结果的差异,了解mNGS在慢性子宫内膜炎病原学诊断中的优势。方法选取2017年1月至2021年12月我院生殖中心慢性子宫内膜炎的不孕症患者共计500例,同时取子宫内膜标本送检,每份标本均分为2份,1份行传统微生物培养法检测病原体,另1份行mNGS法检测病原体,统计治疗前两种方法检测出的病原体数量与种类、微生物检出阳性率以及两种检测方法的一致性,并于治疗后对两种方法的复检阳性率进行比较。结果传统微生物培养法的检出阳性率为20.80%;mNGS法的检出阳性率为79.40%,有显著性差异(P<0.05)。通过传统微生物培养法共检出104例,致病菌包括:肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、链球菌、粪肠球菌等。通过mGNS法共检出397例,除上述致病菌外,还检测出了细菌(阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌)、病毒(巨细胞病毒、乳头状瘤病毒)、支原体(解脲脲原体)。在500例子宫内膜标本中,两组检测结果完全不一致的有105例(21.00%),检测结果不完全一致的有241例(48.20%),检测结果完全一致的有154例(3.00%)。经后续治疗后,传统微生物培养法复检阳性率为13.46%,mNGS法复检阳性率为15.87%,有显著性差异(P<0.05)。以培养结果为金标准,mNGS的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。结论mNGS法在慢性子宫内膜炎病原体的诊断方面较传统微生物培养法敏感度更高,对病原体检出能力更强,尤其在少见病原体诊断方面更具优势。

宏基因组学第二代测序技术在慢性子宫内膜炎患者中的应用分析

目的研讨宏基因组学第二代测序在慢性子宫内膜炎(CE)患者微生物检测中的应用及后续对治愈率的影响。方法选取2017年1月至2020年12月在该院生殖中心诊断为CE的不孕不育患者共139例作为研究对象,随机分为两组进行子宫内膜标本微生物培养和宏基因组学第二代测序检测,分析两组的微生物阳性率和CE治愈率。结果组1微生物检测阳性患者17例,阳性率为20.00%;组2微生物检测阳性患者43例,阳性率为79.63%,差异有统计学意义(P<0.05);两组进行相应的抗菌药物治疗后,组2的治愈率显著高于组1,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用宏基因组二代测序的方法,能显著提高患者子宫内膜微生物检测的阳性率和CE患者的治愈率。

宏基因组学第二代测序对肺部感染的临床指导价值

目的探讨宏基因组学第二代测序(mNGS)对肺部感染的临床指导意义。方法收集43例住院肺部感染患者的临床数据,均采用mNGS技术和传统病原学检测技术进行病原体检测,评价mNGS技术在微生物病原体种类数、灵敏度、检测时长方面的优势。结果mNGS在微生物总的检出种类数量明显高于传统检测技术,差异有统计学意义(χ^(2)=7.85,P<0.05)。43例患者通过mNGS技术检测,28例检测出病原体并判读为致病原,灵敏度为65.12%,包括非重症患者18例,灵敏度为64.29%;重症患者10例,灵敏度为66.67%。通过传统检测技术检测出16例,灵敏度为37.21%;包括非重症患者9例,灵敏度32.14%;重症组7例,灵敏度46.67%。mNGS检测总灵敏度、非重症患者和重症患者的灵敏度均明显高于传统检测技术,差异均有统计学意义(χ^(2)分别=9.65、9.72、6.18,P均<0.05)。mNGS检测时间平均为(2.31±0.62)d,传统检测技术平均为(3.84±0.93)d,mNGS检测用时明显少于传统检测技术,差异有统计学意义(t=4.29,P均<0.05)。结论mNGS技术在检测微生物病原体种类数、灵敏度、检测时长方面均优于传统成熟技术,结合临床表现调整治疗方案患者可以明显受益。

第二代测序技术用于全膝关节置换术后假体周围感染诊断的临床价值

目的探讨第二代测序技术(NGS)用于全膝关节置换术后假体周围感染(PJI)诊断的临床价值。方法收集2017年1月1日至2019年12月1日温州医科大学附属第三医院就诊的全膝关节置换术后临床怀疑为PJI的15例患者的关节液,进行细菌培养和NGS检测。NGS检测经DNA提取、文库构建及测序,最后进行数据处理与分析来寻找病原菌,并与细菌培养结果进行比较分析。结果15例患者的关节液细菌培养阳性10例,阴性5例。NGS检测15例患者关节液中均发现细菌,10例患者细菌菌属与细菌培养结果一致,其中9例的优势菌群(丰度最高)与细菌培养结果一致。关节液细菌培养阳性的10例标本中,NGS检测细菌属种类(15种)多于细菌培养检出的细菌属种类(10种),差异有统计学意义(P=0.042)。细菌培养阴性的5例标本NGS均检出细菌。结论NGS检测是一种PJI快速、准确的诊断方法,能检出常规细菌培养以外的细菌,特别对于细菌培养阴性的标本更具诊断意义。

基于第二代测序数据识别肿瘤基因突变的工具比较

使用第二代测序数据来发现癌细胞中的基因组突变,一直是很重要的科学应用问题。此研究使用一个癌症病人的大量数据,评估了甄别基因组突变的几个现有工具。经过比较各工具的方法和正确率,本文发现各自都有自己的优点和缺点。针对这些优缺点,本文提供一些建议,让工具使用者能更好地选择合适的工具。