基于三代测序技术高温和中高温大曲真菌多样性解析及酵母菌的分离鉴定

为明确不同类型大曲真菌多样性及可培养酵母菌的差异,本研究采用三代测序技术对高温和中高温大曲的真菌类群进行了解析,并结合传统微生物纯培养方法和分子生物学技术对其蕴含的酵母菌资源进行挖掘。α多样性分析结果表明,2种类型大曲真菌群落丰富度和多样性上存在显著差异(P<0.05);种属分析结果表明,高温大曲主要以疏棉状嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)为主,平均相对含量为73.81%,中高温大曲主要以多育曲霉(Aspergillus proliferans)为主,平均相对含量为52.58%;β多样性分析结果表明,高温和中高温大曲真菌群落结构存在非常显著的差异(P<0.01);LEfSe分析表明,嗜热真菌属(Thermomyces)和曲霉科(Aspergillaceae)可以分别作为高温和中高温大曲的生物标志物;纯培养技术结果表明,从10份大曲样品中共分离得到18株酵母菌,高温和中高温大曲的优势分离株均为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。由此可见,高温和中高温大曲真菌多样性上存在明显差异。

第二代测序技术下双歧杆菌三联活菌辅助治疗重症肺炎患者的价值研究

目的研究第二代测序技术(NGS)下双歧杆菌三联活菌(BDT)辅助治疗重症肺炎患者的价值。方法选择2020年12月—2022年12月石家庄市人民医院收治的重症肺炎患者,共100例,按照统计学随机法将其分为对照组、实验组,均50例,对照组应用经验性抗感染治疗,实验组应用NGS对患者肺泡灌洗液行病原学分析,根据检出的病原菌做针对性抗感染治疗,另加用BDT辅助治疗。对比观察两组疗效;对比两组治疗前后肠道益生菌(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌,粪肠球菌)、炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)]变化及肺部感染情况;对比治疗后两组肺部病原菌检出阳性率。结果治疗后,实验组治疗总有效率及双歧杆菌、嗜酸乳杆菌,粪肠球菌计数明显高于对照组(P<0.05),肺部感染评分、肺部病原菌检出阳性率及IL-6、PCT、CRP明显低于对照组(P<0.05)。结论NGS有助于指导重症肺炎患者的抗感染治疗,另加用BDT辅助治疗重症肺炎可改善患者肠道菌群、减轻肺部感染的临床效果。

靶向第二代测序技术在病原体检测中的作用

病原学的早期准确识别对于感染性疾病的诊治至关重要。随着基因检测技术的发展,第二代测序技术正被逐步应用于临床病原体的检测。作为第二代测序技术的一个分类,靶向第二代测序技术能选择性地扩增或富集感兴趣的基因组区域,再进行大规模测序,快速准确地检出目标病原体。本文对靶向第二代测序技术在感染性病原体检测中的应用现状进行综述,讨论靶向第二代测序技术作为感染性疾病诊断工具的应用前景。

低误差第二代测序技术应用于肿瘤研究和药物致突变性风险评价的进展

目的:探讨低误差第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术在肿瘤研究和药物致突变性评价领域的进展。方法:通过查阅文献、收集资料等方法,汇总近年来低误差NGS技术进展、优缺点以及在肿瘤研究和药物致突变性/致癌性评价的应用。结果:传统的NGS技术的背景误差率较高,限制其在低频率突变检测方面的应用。近年开发的多种低误差NGS技术(即校正测序错误的NGS,errorcorrected next-generation sequencing,ecNGS)可将NGS的检测误差率降低至10^(-7)~10^(-4)或甚至更低,满足肿瘤临床监测和指导用药的需求。此外,HiFi-Seq和PECC-Seq等技术的最低误差率可降低至10^(-8),可检出药物短期暴露导致的细胞/组织的超低频突变,有助于在药物研发早期评估其致癌性风险。结论:ecNGS技术目前处于开发阶段,尚未标准化,且未在临床、毒理学、风险评估领域推广应用。然而,该方法可直接检出肿瘤早期病变组织中的突变和药物诱导的组织/细胞突变,有望取代或补充现有的致突变性试验方法,纳入相关指导原则,成为药物早期遗传毒性、致癌性筛查的金标准。

宏基因组第二代测序技术在狂犬病诊断中的应用

目的:总结宏基因组第二代测序技术(mNGS)诊断狂犬病临床应用价值。方法:回顾性分析广东省东莞市横沥医院1例和文献报告3例狂犬病诊疗资料。结果:4例患者唾液或脑脊液标本的mNGS检测狂犬病毒结果均为阳性,其中3例患者同时进行了狂犬病毒PCR检测亦为阳性。结论:唾液和脑脊液标本行mNGS检测为临床确诊狂犬病提供依据。

宏基因二代测序技术对胸内淋巴结结核的诊断价值

目的:探讨宏基因二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing,m NGS)在胸内淋巴结结核中的诊断价值。方法:采用回顾性研究方法,搜集2020年12月至2023年9月浙江省中西医结合医院结核病诊疗中心收治的122例疑似胸内淋巴结结核患者临床资料,所有患者均行支气管内超声引导下经支气管针吸活检术(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA)。穿刺标本同时进行mNGS、Gene Xpert MTB/RIF(简称“Xpert”)、PCR-荧光探针法(简称“RT-PCR”)、RNA恒温扩增荧光实时检测技术(简称“TB-SAT”)、BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养(简称“MGIT 960”)和涂片抗酸染色(简称“涂片”),比较6种方法对胸内淋巴结结核的诊断效能。结果:根据诊断标准,122例疑似患者中,最终89例诊断为胸内淋巴结结核,33例为非胸内淋巴结结核患者。以综合诊断结果为参照标准,m NGS对胸内淋巴结结核诊断的敏感度为89.9%(95%CI:81.7%~95.3%)、特异度为87.9%(95%CI:71.8%~96.6%)、准确率为89.3%(95%CI:82.5%~94.2%),AUC值为0.889(95%CI:0.819~0.939),明显高于Xpert、RT-PCR、TB-SAT、MGIT 960和涂片对胸内淋巴结结核检测的敏感度(68.5%、61.8%、33.7%、49.4%和11.2%)、特异度(93.9%、97.0%、97.0%、100.0%和100.0%)、准确率(75.4%、71.3%、50.8%、63.1%和35.2%)和AUC(0.812、0.794、0.747、0.653和0.556)。结论:m NGS检测对胸内淋巴结结核具有较高的临床诊断价值,尤其在其他结核病相关检测均阴性时,该技术可给临床诊断提供重要参考,但与传统的病原学检测手段相比较,特异度仍偏低,尤其在鉴别疾病良恶性时,需结合病理结果进行综合分析。

利用三代测序技术鉴定c.586T>C突变导致的Bel亚型

目的利用PacBio三代测序技术鉴定c.586T>C突变导致的Bel亚型,并分析Bel亚型家系的血型血清学特点。方法ABO血型表型检测使用血清学方法,对ABO正反定型不符的家系标本进行ABO基因第6、7号外显子Sanger测序。利用PacBio三代技术对先证者及其子女的3例样本进行ABO基因全长单体型分析。结果先证者血清学表型为Bel亚型,测序技术鉴定ABO基因序列第7外显子存在c.586T>C位点突变,三代测序单体型鉴定先证者ABO基因型为ABO^(*)BEL(c.586T>C)/O01.02,其长子和长女基因型为:ABO^(*)A1.02/BEL(c.586T>C)、ABO^(*)B.01/BEL(c.586T>C)。结论c.586T>C位点突变是导致本例Bel的分子基础,PacBio三代测序技术能够精准鉴定ABO亚型单体型。

外周血宏基因组二代测序技术对恶性血液病合并发热患者的诊断价值

目的探讨外周血宏基因组二代测序(mNGS)技术对恶性血液病合并发热患者的诊断价值.方法回顾性分析2021年6月至2023年6月在我院住院治疗的恶性血液病合并发热的患者23份外周血mNGS结果,与传统血培养检测结果进行比较,分析其病原谱特征及抗感染的疗效.结果23例患者中,通过外周血mNGS技术检出9例病毒感染、4例细菌感染、2例真菌感染、3例病毒和细菌混合型感染、1例病毒和真菌混合型感染.传统外周血培养仅检出3例细菌感染,主要为肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌,未检出真菌及病毒.外周血mNGS阳性检出率明显高于传统血培养(82.6%vs.13.0%,P<0.05).根据外周血mNGS检测结果进行针对性抗感染治疗,有效率明显优于传统经验性抗感染治疗(73.6%vs.25.0%,P<0.05).结论外周血mNGS技术在恶性血液病合并发热患者的病原学诊断上较传统血培养具有更高的价值,有助于提高临床抗感染的疗效.

二代测序技术在骨关节结核临床诊断中的应用价值

目的:评估二代测序技术(next generation sequencing,NGS)在骨关节结核诊断中的应用价值。方法:采用回顾性研究方法,参照入组标准收集2019年12月至2022年12月河北省胸科医院骨科收治的185例疑似骨关节结核患者临床资料,根据最终临床诊断将患者分为结核组(骨关节结核155例)和非结核组(非骨关节结核30例)。所有患者病灶标本均经手术或穿刺途径获取(包括51份脓液、89份肉芽组织和45份骨组织标本),且均同时送检NGS、BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养(简称“培养”)及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(GeneXpert MTB/R1F,简称“Xpert”)检测。以最终临床诊断为参照标准,比较3种检测方法诊断骨关节结核的检测效能,并分析3种方法检测脓液、肉芽组织和骨组织标本的阳性检出情况。结果:185例疑似骨关节结核患者中,NGS检测骨关节结核的阳性率[63.24%(117/185)]明显高于Xpert[54.05%(100/185)]和分枝杆菌培养[35.68%(66/185)],差异均有统计学意义(χ^(2)=24.982,P<0.001;χ^(2)=37.934,P<0.001)。以最终临床诊断为参照标准,NGS、Xpert和培养法诊断骨关节结核的敏感度分别为74.84%(116/155)、64.52%(100/155)和42.58%(66/155),特异度分别为96.67%(29/30)、100.00%(30/30)和100.00%(30/30),诊断符合率分别为78.38%(145/185)、70.27%(130/185)和51.89%(96/185),Kappa值分别为0.799、0.590和0.504,AUC(95%CI)值分别为0.867(0.693~0.941)、0.703(0.612~0.784)和0.623(0.529~0.717)。NGS检测脓液的阳性率[80.39%(41/51)]明显高于检测肉芽组织[62.92%(56/89)]和骨组织[44.44%(20/45)],差异均有统计学意义(χ^(2)=4.560,P=0.031;χ^(2)=13.335,P<0.001)。结论:NGS技术可明显提高骨关节结核患者病原学阳性检出率,具有较高的检测效能,并以脓液标本的检测诊断价值最高。

基于Nanopore技术的马铃薯甲虫全长转录组测序研究

为深度挖掘马铃薯甲虫的转录组信息与功能基因,本研究采用Nanopore测序技术,针对马铃薯甲虫触角混合组织展开全长转录组测序,成功构建了该物种的全长转录本文库。在研究过程中,通过对转录组数据进行生物信息学分析,完成可变剪接分析、长链非编码RNA鉴定预测分析、新转录本功能注释分析以及转录本的表达量等工作。通过对全长转录本数据进行统计分析,所产出的样品数据clean data达20.24 GB,测序样本质量值达到Q11,共获得全长序列个数为20 278 877。通过对转录本进行基因结构分析,发现5个可变剪切类型中最多的为可变转录终止位点(占比29.21%),新预测的长链非编码RNA数量共有620个,主要为基因间lncRNA (62.4%),共完成了9 622个新转录本功能的注释。本研究可为进一步了解马铃薯甲虫的生物学特性、基因功能研究等提供理论基础。

宏基因组二代测序技术在布鲁菌脊柱炎诊治中的应用价值

目的探讨宏基因组二代测序(mNGS)技术在布鲁菌脊柱炎诊治中的价值。方法手术治疗36例布鲁菌性脊柱炎患者,收集术前血液标本和术中病灶区组织标本(髓核、软骨终板、黄韧带、纤维环),采用Giemsa染色、试管凝集试验(SAT)、血培养、多重聚合酶链式反应技术(PCR)检测和mNGS评估不同组织样本。另选取30例椎间盘突出患者作为阴性对照组。结果静脉血的mNGS、SAT、多重PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。髓核的mNGS与多重PCR检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。软骨终板、黄韧带和纤维环的mNGS检测阳性率均大于多重PCR检测阳性率(P<0.05)。髓核中多重PCR和mNGS检测阳性率均高于静脉血、软骨终板、黄韧带和纤维环(P<0.05)。敏感性、阴性预测值:mNGS均高于Giemsa染色、血培养和SAT(P<0.05);mNGS与多重PCR检测比较差异均无统计学意义(P>0.05)。临床诊断一致性mNGS最好,多重PCR和SAT较好,Giemsa染色一般,血培养较差。结论mNGS可以作为布鲁菌脊柱炎的有效检测手段,其敏感性和准确率高,尤其适用于术前无法明确诊断且术后病理结果为阴性但需确诊的患者,可为布鲁菌脊柱炎的精准治疗提供重要的病原学依据。

第二代测序技术的发展及应用

基于双脱氧核苷酸末端终止测序法的第一代测序技术,由于其通量低、成本高的缺点,逐步被第二代测序技术取代。基于高通量测序的第二代测序技术由于其通量大、可定量、成本低廉的优点,在各个领域方面的研究越来越广泛。该文首先详细介绍了以454测序、Solexa测序和SOLiD测序为代表的第二代高通量测序技术的原理、方法,并将以这3种测序方法为基础构建的3种测序平台的优缺点、适用研究对象、测序精确度等进行了对比总结,然后对第二代测序技术目前在土壤、沉积物、人体、海洋和污水方面等领域的应用情况进行了介绍。最后,对第三代测序技术的发展作了相应展望。

第三代DNA测序及其相关生物信息学技术发展概况

本文介绍了第三代DNA测序的技术原理及应用现状,并对相关的生物信息学技术进行了综述。第三代测序技术以单分子测序为主要特点,目前已广泛应用于食品科学及生命科学研究的各个领域,其代表有Heliscope Bio Science公司的SMS技术、Pacific Bio Sciences公司的SMRT技术等。本文同时归纳总结了基因组学相关的生物信息学发展状况及常用的数据库。

第二代测序技术检测1例假肥大型肌营养不良家系Dystrophin基因突变

目的探讨第二代测序(NGS)技术检测假肥大型肌营养不良患者的可行性。方法用NGS技术检测1例假肥大型肌营养不良(DMD)患者,并用Sanger测序技术对患者基因型进行验证,同时检测家系其他成员基因型。结果 NGS技术结果表明,该患者DMD基因编码区第55号外显子存在1个移码突变c.8087delT(p.Leu2696ArgfsX30),为致病性突变;同时该患者还存在3个错义突变p.Arg2937Gln、p.Arg1745His和p.Asp882Gly,均为已知多态性变异;Sanger测序技术进一步证实了该点突变的存在,同时发现患者母亲为该突变的携带者,患者父亲和妹妹未见该突变。结论 NGS技术可用于DMD基因突变检测,为DMD临床遗传咨询和治疗提供了依据。

第二代测序技术在检测母血浆胎儿游离DNA中的应用研究

母血浆中胎儿游离DNA的发现为遗传疾病的诊断、妊娠相关疾病及无创性产前诊断提出新的研究思路，随着不断对母血浆胎儿游离DNA的检测技术的更新、改进，第二代测序技术的出现使对胎儿游离DNA的理论研究转变为广泛应用，大大促进了人们对母婴一些疾病的认知和预测，避免缺陷儿的出生。本文就母血浆胎儿游离DNA的生物学特性、与临床疾病关系、检测技术的进展以及第二代测序技术在检测母血浆胎儿游离DNA中的应用进展情况进行综述。

第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

背景 某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序（NGS）技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的 探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法 于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者（Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4）和3名表型正常者（Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2）的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果 该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C（p.S228P）杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿（Ⅳ1）CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.

第二代测序技术与无创产前诊断

孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的发现开辟了无创产前诊断的新篇章,借助各种分子诊断技术针对cffDNA进行胎儿染色体疾病、遗传性疾病以妊娠相关疾病的研究迅速成为热点。以高通量、自动化为显著特征的第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术诞生,极大加速了cffDNA的实验室研究进展。目前基于NGS平台,建立的胎儿21/18/13三体综合征的产前基因诊断技术已应用于临床,其他如性染色体非整倍体、双胎妊娠染色体非整倍体、胎儿染色体结构异常疾病以及孟德尔单基因遗传病的研究也因NGS的出现获得了显著的进步。本文就NGS的基本原理、cffDNA的生理特性及NGS在无创产前诊断研究中的进展进行综述。

第二代高通量测序技术用于进口细菌型微生物肥料菌群分析

[目的]分析细菌型微生物肥料菌群结构。[方法]采用第二代高通量测序技术对细菌型微生物肥料菌群结构进行分析。[结果]产品中测序出的111个OUT具体分属于24个属的细菌,其中共有21个OUT鉴定到种;植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)占菌群的主要位置,分别是96.29%和0.66%,其他菌占3.05%;该样品中含有假单胞菌属(Pseudomonas sp.),这提示样品中可能含有植物病原细菌。[结论]将第二代高通量测序技术用于微生物肥料菌群分析,为进出口微生物肥料产品的快速分析提供了一种方法。

第二代测序技术及其在急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征中的运用

第2代测序技术(next-generation sequencing,NGS)悄然取代经典的Sanger测序技术,成为科研人员发掘人类肿瘤疾病遗传学秘密的最实用、最可靠的方法。随着技术的不断更新及完善,进行全基因组测序不再遥不可及。近年来,部分科学家将此项技术运用于血液系统恶性肿瘤的研究,积极推动急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征的全基因组测序的进程,期待从源头上找出部分血液系统恶性肿瘤的致病机理。本文就第2代测序技术及全基因组测序、外显子基因组测序和转录基因组测序在急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征两种疾病中的运用进行综述。

二代测序技术诊断鹦鹉热衣原体肺炎8例

目的探索鹦鹉热衣原体肺炎的临床表现、实验室检查、影像学表现、治疗及随访情况。方法回顾性分析2021年1月至2022年8月经mNGS确诊为鹦鹉热衣原体肺炎的8例患者的临床资料。结果8例患者中男1例,女7例,年龄为33~81岁。4例有鸟类/家禽的接触史。临床表现主要为高热(8/8)、咳嗽(8/8)、咳痰(4/8)、神经系统症状(3/8)。实验室检查提示白细胞升高(4/8)、中性粒细胞比例均升高(8/8)、淋巴细胞比例均降低(8/8);所有患者的C反应蛋白、降钙素原明显升高伴有低蛋白血症(8/8);谷丙转氨酶(8/8)、谷草转氨酶(8/8)、肌酸激酶(4/8)、乳酸脱氢酶(6/8)升高;胸部影像学多表现为斑片状渗出实变(7/8)、团块状实变(1/8),累及单侧居多(7/8)。所有患者均由肺泡灌洗液mNGS确诊,确诊后调整为多西环素(4/8)或奥玛环素(2/8)或莫西沙星(2/8),所有患者均治愈出院。结论鹦鹉热衣原体肺炎有一定的特征性,但临床诊断仍然困难。mNGS检测快、准确性高,有助于早期明确诊断、尽早选用敏感抗菌药物、改善预后。